葛根芩连汤对幽门螺杆菌感染人正常胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的影响及机制研究※

胡婧楠 廖 曼 何 涛 李博林 徐伟超 郭立芳 张春旭

(1.河北省中医院药学部,河北 石家庄 050011;2.河北省中医院疼痛科,河北 石家庄 050011;3.河北省中医院脾胃病科,河北 石家庄 050011;4.河北省中医院设备处,河北 石家庄 050011)

幽门螺杆菌(Hp)高度适应胃环境,全球约50%的人感染Hp[1]。Hp通过黏附在胃上皮细胞上,损害胃黏膜,引发慢性炎性反应,从而进一步扩大胃组织损伤[2]。有报告表明,Hp感染与慢性胃炎、肠上皮化生、胃腺癌和消化不良事件有关[3-4]。因此,找到一种有效的治疗方式,降低机体炎性反应,对于疾病的治疗具有重要意义。p38/丝裂原活化蛋白激酶2(p38/mitogen-activated protein kinase 2,p38/MK2)信号通路是与炎症性疾病密切相关的传导通路,p38/MK2信号通路的激活可引起机体炎性反应加剧,相关炎症因子水平升高[5]。有研究显示,感染和炎症发生时,p38/MK2信号通路被激活,p38、MK2表达水平升高,高表达的p38、MK2可引起机体炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6表达水平升高,从而进一步加剧机体炎性反应,不利于患者康复[6]。葛根芩连汤出自《伤寒论》,主要由葛根、黄连、黄芩和甘草组成,具有清热解毒功效,有调节机体免疫功能等作用[7]。有研究发现,在消化系统疾病中,葛根芩连汤具有显著的治疗效果[8]。但其具体作用机制还不清楚,因此本研究通过建立Hp感染人正常胃黏膜上皮(GES-1)细胞模型,并采用葛根芩连汤进行干预,以探讨葛根芩连汤的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药与仪器 细胞:Hp国际标准菌株ATCC43504,购自北京百欧博伟生物技术有限公司;人GES-1细胞株,购自武汉普诺赛生命科技有限公司。试药:RPMI1640培养基(批号:7BH-9421)、胎牛血清(批号:AF-5150)、胰蛋白酶(批号:cxz-10-31)购自美国Gibco公司;Skirrow琼脂培养基(批号:LA3510)购自北京索莱宝科技有限公司;细胞计数试剂盒8(CCK-8,批号:631254-XV)购自上海优宁维生物科技股份有限公司;TNF-α、IL-1β和IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自上海优宁维生物科技股份有限公司;双染细胞凋亡检测试剂盒(ANNEXIN V-FITC/PI,批号:CA1020),购自美国Sun-Shine公司;总RNA提取试剂盒(批号:TCF-514123)购自武汉三鹰生物技术有限公司;RNA反转录试剂盒(批号:GFXC-367)购自南京建成生物工程研究所有限公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒(批号:YR-6494)购自上海优宁维生物科技股份有限公司;p38(批号:LI-6415)、MK2(批号:OCC-3325)和肌动蛋白β-actin(批号:CB-681)蛋白抗体购自美国Abcam公司;二抗(山羊抗兔,批号:61258)购自南京建成生物工程研究所有限公司。葛根(15 g,批号21083001)、炙甘草(6 g,批号21101822)、黄芩(9 g,批号21091631)、黄连(9 g,批号21100921)均为配方颗粒,购自神威药业集团有限公司,加100 mL无菌水于60 ℃超声溶解,并稀释至不同浓度。阿莫西林胶囊(批号4782111156,国药准字H13023964),购自石家庄制药集团欧意药业有限公司,取1000 mg内容物加100 mL无菌水于60 ℃超声溶解,再稀释至所需浓度。仪器:超净工作台SW-CJ-1D(上海尚净科技有限公司);HWS-80B恒温恒湿培养箱(天津市宏诺仪器有限公司);Multiskan Mk3型酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];5320R 4℃离心机(德国徕卡公司);Mini-PRO TEAN电泳仪(美国伯乐公司);Bio-Rad微孔板阅读器(美国GE Healthcare公司);EVOS M7000倒置显微镜[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];BKQ-B75高压蒸汽灭菌锅(山东博科科学仪器有限公司);FC500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司);荧光定量PCR仪(CFX connectTM型,美国伯乐公司);LAS 4000成像系统(美国GE Healthcare公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的人GES-1细胞从液氮罐中取出,立即放入37 ℃水浴进行细胞复苏,将复苏后的细胞置于RPMI1640培养基中,采用细胞培养皿进行分装,并放置在培养箱中培养[培养条件:5%二氧化碳(CO2),37 ℃]24 h,观察细胞覆盖率,当细胞覆盖率达70%后更换培养基,并加入胰蛋白酶。

1.2.2 Hp培养 取Skirrow琼脂培养基平板,密集划线接种Hp菌株,于37 ℃、微需氧环境[85%氮气(N2)、10% CO2和5%氧气(O2)]中培养48～72 h,用灭菌0.9%氯化钠注射液洗下菌苔并混匀。采用涂片革兰染色后显微镜下检测细菌情况,将菌液用灭菌0.9%氯化钠注射液进行溶解,用酶标仪于550 nm处测定其吸光度值,用麦氏比浊法调至细菌浓度为1108 CFU/mL,4 ℃冷藏备用。

1.2.3 细胞分组 按照葛根芩连汤干预剂量的不同、是否有Hp感染(感染复数MOI为200∶1),将细胞分为空白对照组(正常人GES-1)、模型组(Hp感染+正常人GES-1)、葛根芩连汤低剂量组(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩连汤10 μmol/L)、葛根芩连汤中剂量组(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩连汤20 μmol/L)、葛根芩连汤高剂量组(Hp感染+正常人GES-1+葛根芩连汤40 μmol/L)及阳性药对照组(Hp感染+正常人GES-1+阿莫西林水溶液5 μmol/L)。

1.2.4 CCK-8法检测细胞存活率 在细胞处于对数生长期时加入胰蛋白酶1 mL,并轻微吹打2 min,使细胞完全悬浮。将悬浮的细胞转移到1.5 mL离心管中离心(2000 rpm,10 min),弃上清,加入1 mL RPMI1640培养基,充分悬浮细胞,取一块新的96孔板,每孔加入100 μL细胞悬液,培养箱中培养24 h后弃去培养基并加入新的RPMI1640培养基培养24 h,弃去培养基并加入100 μL培养液和10 μL CCK-8溶液,持续培养3 h,各组设置6个复孔。Bio-Rad微孔板阅读器读取450 nm处的吸光度,重复3次,通过吸光度计算细胞存活率。

1.2.5 细胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平检测 实验末期收集上清液于1支新的离心管中,置于-80 ℃保存、备用。采用ELISA检测上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,根据ELISA试剂盒说明书,对上清液样本进行处理后,采用全自动酶标仪在450 nm波长处检测样本吸光度,并根据标准曲线来计算样品中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 用27 mL去离子水稀释3 mL 10倍浓度的结合缓冲液(10× Binding Buffer)至30 mL,每次3 mL。用1 mL 1倍浓度的结合缓冲液(1× Binding Buffer)重悬细胞,300×g离心10 min,弃上清;用1 mL 1倍浓度的结合缓冲液(1× Binding Buffer)重悬细胞,调整细胞密度为1×106个/mL;每管加入100 μL细胞悬液(1×105个);向每管中加入5 μL 用异硫氰酸荧光素标记的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白(Annexin V-FITC),轻轻混匀后,室温避光孵育10 min;再加入5 μL 荧光染料碘化丙啶(PI),室温避光孵育5 min;最后加入磷酸盐缓冲液(PBS)至500 μL,轻轻混匀,用流式细胞仪检测。

1.2.7 总RNA提取及实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR) 取出培养皿放入无菌操作台,弃去培养皿中的培养液。提取细胞总RNA,然后反转录生成cDNA,并在-80 ℃冰箱保存备用。加样进行PCR反应。配制体系:引物2.25 μL,cDNA 3.0 μL, SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL,去酶水7.5 μL,每个样品设置6个复孔。PCR条件:94 ℃,12 min;96 ℃,12 s;62 ℃,25 s;72 ℃,40 s,共35个循环,采用2-ΔΔct法进行计算。见表1。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白免疫印迹(Western bloting)检测细胞相关蛋白表达 配制蛋白酶K溶液(1 mL PBS加入100 μL蛋白酶K),弃去培养皿中培养液并加入1 mL蛋白酶K溶液,使用细胞刮悬浮细胞,然后破碎细胞并在3000 rpm,4 ℃条件下离心20 min,用加样枪将上清转移至1.5 mL离心管中。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离、转模和封闭后用特异性抗体p38、MK2和β-actin(抗体稀释浓度1∶5000)在4 ℃条件下孵育12 h,孵育后的条带清洗3次(1%吐温),二抗(山羊抗兔,稀释浓度1:1000)孵育2 h,应用LAS 4000成像系统观察结果。

2 结果

2.1 各组人GES-1细胞存活率比较 与空白对照组比较,模型组人GES-1细胞存活率降低(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤各剂量组和阳性药对照组人GES-1细胞存活率均升高(P<0.05),且葛根芩连汤各剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05);阳性药对照组人GES-1细胞存活率与葛根芩连汤高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),与葛根芩连汤低、中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组人GES-1细胞存活率比较

2.2 各组人GES-1细胞炎症因子比较 与空白对照组比较,模型组TNF-α、IL-1β和IL-6均升高(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤各剂量组和阳性药对照组TNF-α、IL-1β和IL-6均降低(P<0.05),且葛根芩连汤各剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05);阳性药对照组TNF-α、IL-1β和IL-6与葛根芩连汤高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05),与葛根芩连汤低、中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组人GES-1细胞炎症因子比较

2.3 各组人GES-1细胞凋亡率比较 与空白对照组比较,模型组人GES-1细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤各剂量组和阳性药对照组人GES-1细胞凋亡率降低(P<0.05),且葛根芩连汤各剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05);阳性药对照组人GES-1细胞凋亡率与葛根芩连汤高剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),与葛根芩连汤低、中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图1。

图1 各组人GES-1细胞凋亡率比较图

表4 各组人GES-1细胞凋亡率比较

2.4 各组人GES-1细胞p38、MK2 mRNA表达水平比较 与空白对照组比较,模型组人GES-1细胞p38、MK2 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤各剂量组和阳性药对照组人GES-1细胞p38、MK2 mRNA表达水平均降低(P<0.05),且葛根芩连汤各剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05);阳性药对照组人GES-1细胞p38、MK2 mRNA表达与葛根芩连汤高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05),与葛根芩连汤低、中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组人GES-1细胞p38、MK2 mRNA表达水平比较

2.5 各组人GES-1细胞p38、MK2蛋白表达水平比较 模型组人GES-1细胞p38、MK2蛋白表达均高于空白对照组(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤各剂量组和阳性药对照组人GES-1细胞p38、MK2蛋白表达均降低(P<0.05),且葛根芩连汤各剂量组效应呈剂量依赖性(P<0.05);阳性药对照组人GES-1细胞p38、MK2蛋白表达与葛根芩连汤高剂量组比较差异均无统计学意义(P>0.05),与葛根芩连汤低、中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表6、图2。

A:空白对照组;B:模型组;C:葛根芩连汤低剂量组;D:葛根芩连汤中剂量组;E:葛根芩连汤高剂量组;F:阳性药对照组

表6 各组人GES-1细胞p38、MK2蛋白表达水平比较

3 讨论

胃癌目前已被列为最常见的癌症之一,且死亡率较高[9]。Hp是一种革兰氏阴性菌,在胃癌的发病机制中起重要作用[10]。Hp感染将导致脲酶、空泡毒素A、CagA蛋白、炎症介质和活性氧代谢产物等致病因子释放,胃黏膜上皮细胞异常增生和凋亡,最终演变成胃癌[11]。因此,降低Hp感染率和提高Hp感染后的治愈率,阐明Hp感染后人GES-1细胞增殖和凋亡的分子机制,对于胃癌防控尤为重要。本研究建立Hp感染人GES-1细胞细胞模型,发现Hp感染可引起人GES-1细胞存活率降低,凋亡水平升高。

炎性反应是大多数疾病的主要诱因。TNF-α是体内一种重要的促炎细胞因子,在多种生理反应中起着至关重要的作用[12]。IL-6是活化T细胞和成纤维细胞产生的关键因子,能够催化和放大炎性反应,其表达水平可有效反映组织细胞损伤的严重程度,作为急慢性炎症临床诊断的有效指标[13]。IL-1β能诱导产生和释放多种炎症因子[14]。本研究检测了各组细胞上清液的相关炎症因子,结果显示Hp感染人GES-1细胞后,细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平均显著增加,说明Hp感染可能会导致炎性反应加剧,从而引发胃部疾病。

炎性反应主要依赖于细胞内的信号通路刺激。丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路是其中一条重要的调控通路,目前已被证实其在Hp感染所致的胃黏膜炎性反应中发挥重要作用[15]。p38及其下游蛋白MK2是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成员,也是引发细胞对细菌脂多糖、氧化应激和炎症等反应的重要介质[16]。p38/MK2信号通路在机体免疫调节过程中起到重要作用,直接或间接参与炎性反应[17]。p38/MK2信号通路通过酶促级联反应被激活,环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)活性增加,刺激机体TNF-α、IL-1β和IL-6表达增加,导致炎性反应加剧[18]。p38/MK2通路的激活还可以引起环氧酶-2(COX-2)的高表达,诱导细胞凋亡,从而造成胃黏膜损伤[19]。研究发现,未经Hp感染的人GES-1细胞难以检测出p38/MK2表达,而Hp感染后p38/MAPK的表达显著增高,表明Hp感染导致的炎性反应与p38/MK2信号通路激活密切相关[20]。本研究对人GES-1细胞进行Hp感染后,细胞中p38、MK2的表达水平均显著增加,提示Hp感染可引起p38/MK2信号通路的激活,进一步刺激TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌,加重炎性反应。

近年来,中药辅助治疗Hp感染已成为研究的热点。葛根芩连汤由多种中草药配伍,具有清热止利、坚阴厚肠功效,可有效缓解肠炎患者疾病症状,同时通过降低血清TNF-α和IL-6表达水平,以降低炎性反应。本研究对Hp感染的人GES-1细胞采用不同剂量的葛根芩连汤进行干预,结果显示葛根芩连汤可有效提高人GES-1细胞的生存率,同时降低细胞凋亡水平,通过分析上清液TNF-α、IL-1β和IL-6和细胞内p38、MK2表达水平,提示葛根芩连汤可能是通过抑制p38/MK2信号通路,从而降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子表达水平,发挥抑制Hp的作用。