探讨半夏泻心汤联合盐酸伊立替康治疗对大鼠肠道菌群的影响

邹媛媛 裴静波 周文英 王亚坤

[摘要] 目的 探討半夏泻心汤对盐酸伊立替康（irinotecan hydrochloride，CPT-11）相关的大鼠肠道菌群的影响。方法 选取70只雄性大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、半夏泻心汤低剂量组、半夏泻心汤中剂量组、半夏泻心汤高剂量组、5-氨基水杨酸组，以及半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组，每组10只。所有大鼠腹腔注射CPT-11溶液造模，根据组别和剂量分别对各组灌胃半夏泻心汤和5-氨基水杨酸。10d后麻醉处死大鼠取材，测量大鼠胃残留率、小肠推进率。采用16S rDNA测序分析大鼠肠道粪便中的菌群种类，采用香浓–威纳（Shannon-wiener）指数计算各组大鼠粪便样品中菌群的多样性。采用索雷森（Sorenson）指数比较各组大鼠肠道菌群16S rDNA-PCR-DGGE图谱的相似性。结果 相比于空白对照组，模型组大鼠增重缓慢，胃残留率升高，肠推进率降低，菌群多样性指数和相似性指数降低，肠杆菌数量增多，拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量减少，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组相比，半夏泻心汤低、中、高剂量组大鼠的胃残留率降低，肠推进率提高，肠杆菌数量减少，拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量增多，差异均有统计学意义（P<0.05）；与半夏泻心汤中剂量组比较，半夏泻心汤与5-氨基水杨酸联合治疗后，大鼠的肠推进率提高，拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗后第10天，半夏泻心汤各剂量组、5-氨基水杨酸组、半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著高于模型对照组（P<0.05），且半夏泻心汤中剂量组的菌群多样性指数、菌群相似性指数显著高于半夏泻心汤低、高剂量组（P<0.05）；半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著高于5-氨基水杨酸组（P<0.05），结论 半夏泻心汤能够显著改善大鼠由CPT-11导致的肠道菌群失调现象，缓解大鼠体质量下降的症状，使得模型大鼠胃残留率降低、肠推进率增加。

[关键词] 半夏泻心汤；盐酸伊立替康；肠道菌群；菌群多样性指数；菌群相似性指数

[中图分类号] R574      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.14.016

To investigate the effect of Banxia Xiexin decoction combined with irinotecan on intestinal flora of experimental rats

ZOU Yuanyuan1， PEI Jingbo1， ZHOU Wenying1， WANG Yakun2

1.Department of Gastroenterology， Xiaoshan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 311201， Zhejiang， China; 2. Department of Critical Care Medicine， Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310044， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Banxia Xiexin decoction on intestinal flora of rats related to irinotecan hydrochloride （CPT-11）. Method Seventy male rats were selected and fed for 1 week after acclimatization， and were divided into blank control group， model control group， low dose group of Banxia Xiexin decoction， medium dose group of Banxia Xiexin decoction， high dose group of Banxia Xiexin decoction， 5-aminosalicylic acid group， and Banxia Xiexin decoction + 5-aminosalicylic acid group according to the random number table method， with 10 rats in each group. All rats were injected intraperitoneally with CPT-11 solution， and each group was given gavage of Banxia Xiexin decoction and 5-aminosalicylic acid according to the group and dose. 10 days later， the rats were anesthetized and executed for sampling， and the gastric residual rate and small intestinal advancement rate were measured. The 16S rDNA sequencing was used to analyze the species of flora in rat intestinal feces， and Shannon-wiener index was used to calculate the diversity of flora in each group of rat fecal samples. The similarity of 16S rDNA-PCR-DGGE profiles of rat intestinal flora in each group was compared using Sorenson index. Results Compared with the blank control group， the rats in the model control group gained more weight slowly， had higher gastric residual rate， increased the number of enterobacter， decreased the number of bacteroide， bifidobacterium， enterococcus and lactobacillus， all with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the model control group， the rats in the low， medium and high dose groups of Banxia Xiexin decoction showed lower gastric residual rate， higher intestinal advancement rate， lower numbers of enterobacteriaceae and higher numbers of bacteroide， bifidobacterium， enterococcus and lactobacillus， all with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the medium dose group of Banxia Xiexin decoction， the combination treatment of Banxia Xiexin decoction and 5-aminosalicylic acid resulted in increased intestinal propulsion rate， and increased the numbers of bacteroide， bifidobacterium， enterococcus and lactobacillus in rats， all with statistically significant differences （P<0.05）. On the 10th day after treatment， the flora diversity index and flora similarity index of each dose group， the 5-aminosalicylic acid group and the group of Banxia Xiexin decoction + 5-aminosalicylic acid were significantly higher than those of the model control group （P<0.05）， and the flora diversity index and flora similarity index of the middle dose group of Banxia Xiexin decoction were significantly higher than those of the low and high dose groups of Banxia Xiexin decoction （P<0.05）. The diversity index and similarity index of bacterial flora in the group ofBanxia Xiexin decoction + 5-aminosalicylic acid were significantly higher than those in the group of 5-aminosalicylic acid （P<0.05）. Conclusion Banxia Xiexin decoction can significantly improve the intestinal microflora disorder caused by CPT-11 in rats， alleviate the symptoms of weight loss in rats， and reduce the gastric residual rate and increase the intestinal thrust rate of model rats.

[Key words] Banxia Xiexin decoction; Irinotecan hydrochloride; Intestinal flora; Microbial diversity index; Bacterial community similarity index

盐酸伊立替康（irinotecan hydrochloride，CPT-11）是常用化疗药物之一，对于肿瘤的复发和恶化具有良好的抑制效果，目前已被认定为治疗转移性结直肠癌的一线药物[1-2]。该药物后易导致腹泻，有研究显示单独使用CPT-11时的腹泻发生率明显低于多种化疗药物联合治疗[3]，但通常多种化疗药物联合治疗效果相比单药化疗效果更佳，因此降低CPT-11联合治疗导致的不良反应是当下临床研究的重点。中医药在CPT-11所致的腹泻中具有一定的缓解作用，现有较多研究采用中药单体或复方药与CPT-11联合治疗肿瘤，取得了较好的临床疗效[4-5]。基于此，本研究拟制了半夏泻心汤组方药，通过检测CPT-11治疗的大鼠肠道菌群变化，探究该组方在CPT-11治疗导致腹泻中的作用。

1  材料与方法

1.1  动物与材料

70只雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量（180±20）g，6～8周龄，购自杭州医学院[实验动物许可证号：SCXK（浙）2022-0002]。CPT-11（生产厂商：Pfizer （Perth）Pty Limited，注册证号：国药准字HJ20160577，规格：5ml/0.1g）按照200mg/ml溶解于乙醇（美国Sigma-Aldrich公司），用含有2%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液稀释至注射所需浓度（150mg/kg）；检测菌群qPCR试剂盒购自美国BioRad公司；高速智能梯度PCR仪购自美国Agilent Technologies公司；高通量实时荧光定量PCR系统为Roche LightCycler 480 Ⅱ（瑞士Roche Life Science公司）。半夏泻心汤组成：半夏15g、甘草15g、黄芩15g、人参15g、干姜15g、黄连5g、大枣4枚，中药材均购买自杭州华东中药饮片有限公司。精密称取30副中药，加8倍量水，煎煮2次，滤过成为流浸膏，水浴继续浓缩至稠浸膏，真空干燥得干浸膏。本研究经浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会审批通过（伦理审批号：ZJCLA-IACUC-20040025）。

1.2  方法

1.2.1  动物分组  所有大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、半夏泻心汤低剂量组、半夏泻心汤中剂量组、半夏泻心汤高剂量组、5-氨基水杨酸组，以及半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组，每组10只，实验周期共10d。半夏瀉心汤剂量按成人口服剂量7倍计算，低剂量、中剂量、高剂量组给药剂量分别为5g/kg，10g/kg，15g/kg，将中药分别浓缩至1g/ml，2g/ml，3g/ml（半夏泻心汤浓度代表每毫升药液中生药的干重），半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组中的半夏泻心汤以中剂量折算。

1.2.2  造模与给药  大鼠腹腔注射150mg/kg的CPT-11溶液，1次/d，连续2d[6]，建立迟发性腹泻模型。各组给药方法如下。①空白对照组：以10ml/kg对大鼠进行生理盐水灌胃，2次/d，共9d；其中第4天和第5天同一时间给予腹腔注射1次150mg/kg的生理盐水。②模型对照组：以10ml/kg对大鼠进行生理盐水灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一时间给予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。③半夏泻心汤（低剂量、中剂量、高剂量）组：以10ml/kg分别对大鼠进行低剂量、中剂量、高剂量半夏泻心汤溶液灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一时间给予各组腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。④5-氨基水杨酸组：以10ml/kg对大鼠进行5-氨基水杨酸溶液灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一时间给予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。⑤半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组：以10ml/kg对大鼠进行半夏泻心汤中剂量溶液+5-氨基水杨酸灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一时间给予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。所有组别大鼠在末次的CPT-11注射5d（实验第10天）后处死，取材。

1.3  观察指标

1.3.1  胃残留率  于实验第10天，各组大鼠禁食不禁水12h后，给予混有炭末的半固体糊10ml/kg灌胃，30min后处死大鼠。剖开大鼠腹部，结扎胃贲门和幽门，取出胃用滤纸吸干胃表面水分后称量胃总重，将胃内容物洗净后称量胃净重，胃残留重量=胃总重–胃净重。胃残留率=胃残留物/所灌半固体米糊重量×100%。

1.3.2  小肠推进率  大鼠处死后，开腹取肠，测量幽门至回盲肠部全长及幽门至半固体糊黑染的距离。小肠推进率=幽门至半固体糊黑染的距离/幽门至回盲部全长×100%。

1.3.3  菌群16S rDNA测序分析  在治疗结束后，采集大鼠新鲜粪便，置于无菌管离心管中，–80℃冻存备用。采用QIAamp? DNA Stool Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN公司）提取大鼠粪便DNA，采用通用引物（F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，R：5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）对16S rDNA V3-V4区进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。采用Illumina MiSeq测序平台对PCR扩增产物进行测序，整个测序服务由微基生物技术（上海）有限公司完成。

1.3.4  PCR-DGGE分析  采用DCodeTM型突变检测系统分离16S rDNA扩增后的PCR产物。设置电泳条件为8%丙烯酰胺凝胶、35%～60%的变性剂、1×TAE缓冲液、120V、60℃电泳8h，采用硝酸银染色15min，加入显色液，在凝胶成像仪上检测结果。通过16S rDNA-PCR-DGGE指纹图谱，采用香浓–威纳（Shannon- wiener）指数评估各组大鼠粪便样品中菌群的多样性，采用索雷森（Sorenson）指数比较各组大鼠肠道菌群16S rDNA-PCR-DGGE图谱的相似性。

1.3.5  肠道菌qPCR检测  参照Zeng等[7]研究方法进行各细菌序列扩增，由罗宁生物公司合成引物序列。各樣本粪便DNA 提取严格按照试剂盒说明书进行，qPCR扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性10s，54℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，72℃延伸5min。

1.4  统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  体质量和胃肠动力比较

给药后，与空白对照组比较，模型对照组大鼠增重缓慢、胃残留率高、肠推进率低（P<0.05）。与模型对照组比较，半夏泻心汤低、中、高剂量组和5-氨基水杨酸组大鼠的胃残留率显著降低（P<0.05），肠推进率显著提高（P<0.05）；治疗后的半夏泻心汤中剂量组和5-氨基水杨酸组大鼠显著重于模型对照组（P<0.05）。半夏泻心汤与5-氨基水杨酸组大鼠的肠推进率显著高于半夏泻心汤中剂量组（P<0.05）；半夏泻心汤与5-氨基水杨酸组大鼠的胃残留率显著低于5-氨基水杨酸组（P<0.05），肠推进率显著高于5-氨基水杨酸组（P<0.05），见表1。

2.2  肠道菌群多样性指数及相似性指数比较

治疗第5天和第10天后，模型对照组大鼠的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著低于空白对照组大鼠（P<0.05）。治疗后第10天，半夏泻心汤各剂量组、5-氨基水杨酸组、半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著高于模型对照组（P<0.05）；且半夏泻心汤中剂量组的菌群多样性指数、菌群相似性指数显著高于半夏泻心汤低、高剂量组（P<0.05）；半夏泻心汤+5-氨基水杨酸组的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著高于5-氨基水杨酸组（P<0.05），见表2。

2.3  肠道菌群数量比较

与空白对照组大鼠相比，模型对照组大鼠的肠杆菌数量显著增多，拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量显著减少（P<0.05）。半夏泻心汤低、中、高剂量组大鼠的肠杆菌显著低于模型对照组（P<0.05），拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量显著高于模型对照组（P<0.05）。治疗后，半夏泻心汤低、高剂量组大鼠的肠杆菌数量显著多于半夏泻心汤中剂量组（P<0.05），半夏泻心汤低、高剂量组的拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量显著低于半夏泻心汤中剂量组（P<0.05）。半夏泻心汤与5-氨基水杨酸组的拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量均显著高于5-氨基水杨酸组（P<0.05），见表3。

3  讨论

CPT-11可引起机体肠道功能失调，导致机体消化吸收能力下降，因此在临床上常表现为日益消瘦[8]。本研究通过给予大鼠CPT-11腹腔注射，建立CPT-11迟发性腹泻大鼠模型，结果显示模型组大鼠临床表现为增重缓慢、胃残留率高、肠推进率低，说明CPT-11大鼠模型构建成功。中医认为，化疗药物乃实毒侵袭机体损害肠道，病位在肠道，涉及肝、肾、脾等多个器官，故应以调和中焦脾胃、增强免疫为主，配合采用清热化湿、疏肝理气治疗。本研究使用半夏泻心汤，半夏具有降腻止呕、温胃消痞的作用；黄芩性清寒、具有清泻里热的功效；人参主治气虚欲脱、脾气不足；干姜温和散寒，可助半夏温胃消痞；黄连主治湿热痞满，恶心呕吐；大枣可补气血，补脾益气；甘草具有补脾益气、调和诸药的功效。有研究显示，半夏泻心汤可促进生长因子的表达，降低舒血管肠肽的分泌，进而促进胃溃疡愈合、促进胃排空[9]。有研究显示，CPT-11可与多种中药联合且发挥良好的功效，如与穿心莲内酯联合可调节结肠癌细胞凋亡[10]，其与人参健脾丸联合治疗可致迟发性腹泻以及调控肠道菌群和血清炎症因子[11]。本研究结果显示，给予CPT-11模型大鼠半夏泻心汤治疗后，模型大鼠症状得到缓解，表现为体重增加、胃残留率降低、肠推进率增加，说明在临床疗效方面半夏泻心汤具有改善CPT-11对机体肠道损伤的作用。

肠道黏膜屏障遭到损坏后，肠道菌群的稳态将会打破，主要表现在肠道菌群数量、丰度和结构组成上出现变化。本研究对给药大鼠粪便菌群进行动态跟踪观测，模型组大鼠的菌群多样性指数、菌群相似性指数均显著低于健康状态下的大鼠，而半夏泻心汤治疗模型大鼠后，大鼠的菌群多样性指数、菌群相似性明显升高。此外，与健康状态下大鼠相比，模型组大鼠的肠杆菌明显增多、拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量明显减少。半夏泻心汤治疗模型大鼠后，大鼠的肠杆菌明显减少、拟杆菌、双歧杆菌、肠球菌和乳酸杆菌数量回升。肠杆菌是条件致病菌，拟杆菌主要生产乙酸、丙酸、琥珀酸，双歧杆菌主要生产乙酸和乳酸，乳酸杆菌主要生产乙酸和乳酸，乙酸和丙酸的含量与肠道益生菌具有正相关性，其水平变化可反映肠道菌群的健康状况[12]。由此可知，半夏泻心汤可改善CPT-11导致的大鼠肠道菌群丰富度和数量的降低，促进益生菌的增殖，抑制条件致病菌的生长。有研究发现，半夏泻心汤治疗可减轻化疗相关性腹泻的产生，且其调控机制与调节肠道菌群有关[13]。此外，目前多项研究显示半夏泻心汤可以调节肠道菌群的稳态平衡[14-15]，这与本研究结果一致，推测半夏泻心汤组方中各中药成分具有抗菌消炎的作用，并可在保护肠道损伤的同时维持菌群生态，由此说明半夏泻心汤能改善肠道菌群比例、调节肠道菌群稳态。

综上所述，半夏泻心汤能够显著改善大鼠由CPT-11导致的肠道菌群失调现象，缓解大鼠体重下降的症状，使得模型大鼠胃残留率降低、肠推进率增加。

[参考文献][1] 姚强， 徐萍， 金俊，等. 益气健脾方辅助伊立替康联合替吉奥一线治疗晚期结直肠癌52例[J]. 临床医药文献电子杂志， 2020， 7（7）： 155–156.