红曲色素组分分析与功效评估研究进展

林 瑾， 周康熙

( 1. 闽江师范高等专科学校 化学与生物技术学院， 福建 福州 350109；2. 福州大学 食品科学技术研究所， 福建 福州 350108 )

0 引言

近年来由于人们对天然色素的需求量增加，红曲色素日益受到重视。 红曲色素是红曲霉产生的次级代谢产物，是一种安全性较高的多组分混合色素[1]。 它被用于肉制品、腐乳、红曲黄酒等食品及口红等化妆品的着色，并兼具抑菌、抗氧化、降脂等功效[2]。 工业化应用时，红曲色素的粗提物就能具有良好的着色、防腐、保健等效果，但在进行功效评估时，需先对其进行分离纯化和表征[3]。 本文综述了红曲色素的分离纯化、表征与功效评估方面的研究进展，同时提出组分与功效评估方面有待改进之处，旨在为红曲色素进一步开发应用提供思路。

1 红曲色素的提取与分离纯化

红曲色素来源于红曲霉，是一类聚酮化合物的混合物，一般可经过红曲霉发酵培养后获得，也可从红曲米中提取。 根据最大吸收波长的不同，红曲色素通常可分为红、橙、黄三类。 通过菌株筛选、优化发酵条件、基因修饰等技术，可以有效提高红曲色素的产量。 为了更深入地认识和研究红曲色素的结构和性质，通常需要对其进行提取和分离纯化。

1.1 提取

红曲色素多以醇溶性色素存在于红曲霉胞内，而水溶性色素多分泌于胞外[4]。 提取时遵循相似相溶原理，水溶液可提取水溶性红曲色素，醇溶性红曲色素可利用乙醚、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂提取，有机溶剂还可改变细胞膜与细胞壁的通透性，有利于胞内色素溶出。 乙醇溶液是比较常用的提取溶剂，成本低、易挥发，并能蒸馏回收，且粗提物中残留的微量乙醇并不影响色素的实际应用，因此乙醇浸提法被广泛应用。

浸提法的提取率有限，通常需要辅以其他方式来提高提取率，常见的方法包括改变体系的温度和pH 值、微波辅助提取、超声波辅助提取、添加表面活性剂、CO2超临界萃取等，它们通过细胞破碎或增加红曲色素溶解性来优化提取率。 工业化应用时要考虑提取工艺的可行性和成本。 CO2超临界萃取法对设备要求高，成本高，工业化应用难度较大。 表面活性剂能提高红曲霉发酵的色素产量及提取量，但该方法目前尚处于科研试验阶段，在生产实际中面临不少难题，如表面活性剂难以完全去除、色素组分与萃取剂紧密结合难以洗脱、所用的表面活性剂难于符合当下法律法规等。改变体系的温度和pH 值法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法工艺简单、成本低，更适合工业化应用。

1.2 分离纯化

提取红曲色素后，为明确其主要功效成分，往往需要对其进行分离纯化。 红曲色素按颜色可分为红曲红色素、红曲橙色素、红曲黄色素三大类。根据实际需求可采用不同的分离纯化方法。 常用的分离纯化方法有薄层色谱法、柱层析法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法等。 这些方法根据不同红曲色素在同一体系中的吸附解离程度不同而分离。

薄层色谱法可低成本地获取样品中红曲色素的构成。 黄艳等以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/1(V/V)的展开剂对红曲色素进行薄层色谱分离，发现Monascussp.W1 色素有1 条橙色条带和5条黄色条带[5]。 屈炯等通过薄层层析法以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/1(V/V)为展开剂分离出7种红色素； 以正己烷/乙酸乙酯/石油醚＝30/17/15(V/V)为展开剂分离出4 种黄色素； 以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/2(V/V)分离出2 种橙色素[6]。

当需要粗分体积较大的红曲色素时， 可选用柱层析法。 徐伟等以正己烷/乙酸乙酯＝5/1(V/V)的混合液分离了红曲黄色素， 以乙酸乙酯分离了红曲橙色素， 以乙酸乙酯/甲醇＝5/1(V/V)的混合液分离了红曲红色素[7]。 杨强等以正己烷/乙酸乙酯＝1/8(V/V)的混合液通过硅胶柱分离出红曲黄色素[8]。

薄层色谱法和柱层析法适合进行粗分离， 而高效液相色谱法能更好地分离出单一组分。Mukherjee 等利用半制备型的高效液相色谱分离出了一种新的红曲红色素[9]； Huang 等建立了新的液相检测方法并从红曲米中分离检测出了红斑素和红曲红素[10]。

“高速逆流色谱技术” 是近几年兴起的一项物质分离新技术， 它的固定相和流动相都是液体， 避免了传统分离纯化方法可能导致部分红曲色素被固体的固定相不可逆吸附的问题。 郑允权等构建了高速逆流色谱分离方法并分离了6 种红曲色素， 纯度均大于98.5%[11]。 薛春茂将正己烷/甲醇/水静止分层后， 上层为固定相、 下层为流动相， 该方法对红曲素和红斑红曲素分离效果良好[12]。

上述红曲色素的分离纯化方法中， 薄层层析法、 柱层析法和高速逆流色谱法都需要再借助其他的检测手段来确定物质的纯度， 如薄层层析法和柱层析法常与紫外-可见分光光度计联用、 高速逆流色谱需要与高效液相色谱联用。 液相色谱法可以最直观地得知分离效果， 但色素组分复杂， 要分离出目标组分的色素往往需要检测条件上的摸索。

2 红曲色素的表征

2.1 结构表征

为探知未知色素的结构与性质， 需要对其进行表征。 红曲色素常用的结构表征方法有红外光谱法、 核磁共振法和质谱法等。

红外光谱可以快速进行红曲色素的结构变化表征。 张金彪等以碱解法制备水溶性红曲红色素[13]。 红外光谱表明， 碱解后， 红曲色素在1 715和1 200 cm-1处的特征峰消失了， 表明内酯键已被水解； 在1 600 和1 400 cm-1处出现了新的吸收峰， 生成了羧酸盐。 紫外-可见光谱显示，红曲红色素在碱解之后， 其最大吸收波长488 nm，比反应前蓝移了12nm， 因而颜色偏向于橙色。

当要进行结构推断时， 往往需要多种手段联合使用。 Mukherjee 等利用紫外可见分光光谱法、气相色谱质谱联用、 红外光谱法和核磁共振联用技术， 对分离出的红色素进行结构表征， 该化合物为9-(1-羟基己基)-3-(2-羟丙基)-6a-甲基-9，9a-二氢呋喃[2，3-h]异喹啉-6， 8(2H，6aH)-二酮， 分子式为C21H29NO5[9]。 Liu 等综合利用红外光谱、 核磁共振和质谱三种方法， 对红曲黄色素进行结构表征， 确定其化合物为苯甲醛衍生物， 具体结构为6-(4-羟基-2-氧戊基)-3-甲基-2，4-二氧环己烷甲醛， 分子量为439.2[14]。

目前已探明分子结构的红曲色素， 除了6 种最常见的色素外， 还存在其他种类的色素。 2012年， Feng 等通过前人的研究报道总结了已探明结构的52 种红曲色素[15]； 2019 年， Chen 等又综合了近年来对红曲色素结构的研究， 补充已探明的红曲色素至100 多种[16]。

2.2 性质表征

红曲色素的性质表征能够加深人们对其性质的认识。 红曲色素的色调、 稳定性及溶解性是它在应用过程中最受关注的三个性质。

色调。 由于红曲色素成分复杂， 扫描其全波长光谱所得的曲线是所有色素组分吸光值叠加的结果。 部分学者将410、 465、 505 nm 及其附近波长分别定性为红曲黄色素、 红曲橙色素、 红曲红色素的特征吸收波长[17]。 但此定性方法在黄色素和橙色素的判别上有待考量。 由红曲红色素经过化学方法转化的红曲黄色素， 其最大吸收波在470～490 nm 之间， 比红曲橙色素的最大吸收波长更长； 在日本标准中， 红曲黄色素的吸光值范围在458～468 nm 之间， 韩国的标准在460 nm左右[18]。 许赣荣等在综合多份红曲黄色素样品全波长检测的基础上， 提出了以色调辅助判断红曲色素颜色的观点， 利用不同颜色对应的吸光值的比值作为色调判断的依据[19]。 目前已有其他学者使用色调这一指标对含红曲色素的样品进行颜色判断: 李瑞杰等以 OD400nm/OD510nm和OD400nm/OD470nm来跟踪发酵液颜色随发酵时间变化的情况[20]； 杨成龙等以OD505nm/OD388nm为色调判断发酵液及菌丝体是否偏红[21]。

稳定性。 温度、 pH 值及光照等条件会影响红曲色素的稳定性。 Shi 等研究表明， 红曲色素在pH ＝2.5 ～8.0 的条件下吸光值会发生变化，同时在pH 值较高时， 橙色素与氨基化合物的胺反应显著增强， 使橙色素含量降低[22]。 Jeon 等通过实验表明， pH＞11 时红曲色素降解速率加快； 降解速率随着温度的升高而增加， 其光稳定性高低顺序为: 暗室＞紫外光＞荧光＞日光[23]。Vendruscolo 等探讨了红曲发酵液中橙、 红色素的稳定性， 两种色素的热解遵循一级动力学反应， 降解常数的温度依赖性遵循阿伦纽斯模型[24]。 Jung 等探究表明， 红曲色素的18 种氨基酸衍生物的稳定性与浓度呈正相关， pH 值的增加使色素稳定性降低[25]。

溶解性。 红曲色素的溶解性与结构、 溶剂性质有关。 多数红曲色素组分的醇溶性比水溶性要好， 在工业化应用中， 往往要增强其水溶性。 半天然水溶性红曲黄色素可从天然醇溶性红曲红色素转化而来。 红斑素和红曲红素分子中的环羰基在含硫化合物的作用下还原成羟基， 在碱性条件下分子中的内酯键打开形成羧酸盐， 该过程会改变色素的溶解性[26]。 在不破坏红曲色素结构情况下， 可采用包埋的方法增加其水溶性。 徐洋等利用淀粉类化合物对红曲色素包埋后喷雾干燥，能增加色素的水溶性[27]。

3 红曲色素的功效评估

据《本草纲目》 记载， 红曲主治消食活血、健脾燥胃； 治赤白痢、 下水谷； 治女人血气痛及产后恶露不尽。 这说明了红曲的传统药用价值。红曲色素作为红曲的主要活性物质之一， 自古以来被人们用以肉制品着色、 制作腐乳、 酿造黄酒以及中医入药。

现代科学研究表明， 红曲色素具有特殊的官能团和共扼结构， 有抗氧化、 降血脂、 降血糖等生物活性， 可以调节机体脂代谢和糖代谢， 抑制氧化应激反应和炎症反应等[28]。 目前， 红曲色素的功效评估方法主要有体外实验和动物实验。

3.1 体外实验

体外实验是功效评估的快速手段之一， 目前通过体外实验已探明的红曲色素的功效有: 抗氧化性、 抑菌活性、 抗肿瘤性等。

不同底物发酵而得的红曲色素种类及含量不同， 其抗氧化活性也不同。 Srianta 等证明了用大米为原料固态发酵红曲霉所产生的红曲色素对DPPH 的清除能力优于玉米、 全高粱和高粱麸皮这三种原料发酵产生的红曲色素， 且色素含量越高抗氧化活性越高[29]。 Li 等采用相转化法制备了一种包裹红曲黄色素的新型玉米油基纳米乳液， 该物质不仅有良好的DPPH 自由基清除能力， 还可以提高脂肪酶的水解能力[30]。 陈忠旭构建了肾小球内皮细胞氧化损伤模型和高糖损伤模型， 通过实验观察红曲色素对这些损伤模型的保护作用， 结果表明， 红曲色素可以下调糖尿病肾病相关因子的表达， 提高抗氧化蛋白表达， 提高氧化损伤的肾小球内皮细胞的活力和抗氧化能力， 保护线粒体， 抑制了细胞凋亡和细胞炎症的发生[31]。 此外， Wu 等研究发现， 不同结构红曲黄色素的抗氧化和抗炎活性不同， 这也表明红曲色素的功效与其组分息息相关[32]。

红曲色素的抑菌活性同样与其组分相关。Kim 等研究表明， 红曲色素的抑菌活性与其附着力有关， 较高抑菌活性的疏水性色素对大肠杆菌的吸附率优于低抑菌活性的亲水性色素[33]。Wong 等通过中子和X 射线诱变出了一株紫色红曲霉， 它对芽孢杆菌的抑菌活性比野生菌株更强， 且抑菌活性与组分Monascidin 有关[34]。Vendruscolo 等对红曲霉CCT 3802 进行液态深层发酵， 其产生的红曲橙色素对金黄色葡萄球菌有抑制作用， 而红曲红色素除了能够抑制金黄色葡萄球菌以外， 还能抑制大肠杆菌[35]。

红曲色素具有抗肿瘤性。 Chang 等利用高粱废液发酵红曲霉CWT715， 其发酵液对肝癌细胞SK-Hep-1 的抗侵袭能力与色素含量呈正相关[36]。 Chiu 等利用电离辐射和红曲色素联合抵御PC-3 人前列腺癌细胞， 其联合疗法可增强DNA 损伤和内质网应激， 诱导PC-3 细胞自噬，联合治疗比单独治疗疗效更佳[37]。

3.2 动物实验

红曲色素作为一种药食两用的添加剂， 其药理学功效需要动物实验验证。

动物实验表明， 红曲色素具有抗肿瘤、 减肥降脂等作用。 例如， Akihisa 等构建了小鼠皮肤癌变的动物模型， 实验表明红曲色素对小鼠癌变具有显著的抑制作用[38]。 Rezaei 等利用紫色红曲霉所产的色素饲喂大鼠， 结果表明添加了红曲色素的实验组的大鼠血清胆固醇和甘油三酯水平显著降低[39]。 Ning 等利用卵磷脂和壳聚糖之间的静电组装构建了红斑素的卵磷脂/壳聚糖纳米药物载体， 并通过CCK-8 实验证明了该纳米药物对小鼠乳腺癌4T1 细胞具有显著毒性， 这也证明了红斑素的抗肿瘤效果[40]。 分子生物学技术在动物实验中的应用有利于从基因表达的角度揭示红曲色素功效的机理。 Lee 等通过大鼠饲养实验证明了红曲色素具有显著的抗肥胖作用， 能够抑制CCAT/增强子结合蛋白β(c/ebpβ)表达，增加脂肪酶活性， 从而抑制脂肪生成[41]。 Lee 等用两种红曲色素组分(Monascin 和Ankaflavin)连续28 天投喂患有阿兹海默症的大鼠， 结果显示这两种红曲色素降低了海马和皮层的p-tau、 载脂蛋白E(apo E)和β 位点淀粉样前体蛋白裂解酶(bace)的表达水平， 提高了可溶性淀粉样前体蛋白α(SAPα)的表达水平， 从而提高患病大鼠的记忆和学习能力[42]。 汪攀对一株高产红曲色素的紫色红曲霉M-32 进行了基因组测序， 并将该菌株制成菌粉后添加到饲料中饲喂凡纳滨对虾， 结果表明该菌粉能显著提高凡纳滨对虾肠道益生菌的丰度， 并增强其对副溶血性弧菌感染的抵抗力[43]。

近年来， 国内外一些研究团队陆续提供了红曲霉基因组的有关数据， 这有助于从遗传特性的角度为红曲色素的生物合成提供有用的信息[44]。此外， 转录组学和代谢组学技术也逐渐被应用于红曲色素的相关研究中， 有利于进一步揭示红曲霉生物合成红曲色素的代谢机理[45-46]。

4 红曲色素研究的发展方向

4.1 挖掘红曲色素主要功效成分

目前对红曲色素组分的研究主要集中于Monascorubramine、 Rubropunctamine、 Monascorubrin、 Rubropunctatin、 Monascin 和Ankaflavin 这6 种。 然而红曲霉种类多， 所产色素的种类及含量也各不相同， 这就需要更加深入挖掘红曲色素这一复杂而又宝贵的资源。 在探讨红曲色素的性质及功效时， 应明确色素中具体的成分。 此外，对红曲色素粗提物进行降脂和抑菌功效评估时，要排除其他代谢物对试验结果的干扰， 例如红曲霉的次级代谢产物中， 他汀类物质具有降脂作用， 桔霉素具有抑菌作用。 色素粗提物的功效往往不仅取决于某一种色素， 而可能是多种色素的协同效果， 因而这些色素需要被明确。

4.2 建立色素组成与功效评估之间的关系

实际应用时， 单组分的红曲色素产量有限，且分离纯化成本较高。 另外， 多种功能性色素组分的协同作用往往优于单组分色素的功效。 当前红曲色素的应用仍集中于食品的着色与防腐， 若能建立成分与功效间的关系， 不仅可以开拓保健品市场， 还可以降低医药工业中相关药物的成本。

当色素组分的化学结构已知时， 可根据其性质推测可能发生的生化反应， 也有利于对其功效进行机理分析。 此外， 在分析其功效时， 应对其药理作用做机理分析， 才能更好地为红曲色素的应用提供借鉴。

4.3 寻找非红曲霉来源的“红曲色素”

部分红曲霉因产生桔霉素而受到安全性质疑，尽管从菌株筛选、 培养条件优化、 代谢调控、 基因敲除等手段能降低桔霉素含量， 但红曲色素制品依然可能含有桔霉素。 除了红曲霉以外， 其他微生物也会产生红色的色素。 据报道， Qiu 等从银杏枝条中分离出一株产紫青霉Penicillium purpurogenumSX01， 能产大量红色素[47]； Jin 等从产紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3 菌株中分离出了一种红色素， 该色素具有较好的抗氧化和抑菌活性[48]； Venkatachalam 等从印度洋留尼汪岛珊瑚礁的外坡分离出一株真菌Talaromyces albobiverticillius30548， 并从中分离出4 种结构类似于红曲色素的物质[49]。 从大自然中寻找高产功能性红色素的高安全性菌株可能是未来红曲色素的一个发展方向， 对这些新发现的菌株进行代谢产物解析及功能性评价， 有望推动色素行业的发展。

5 结语

红曲色素的应用历史悠久， 随着现代医学、生物学的发展， 红曲色素的保健功能逐渐受到重视， 应深入挖掘红曲色素这一宝贵资源。 菌株选育、 培养条件优化、 代谢调控、 基因编辑等方法都能定向提高色素产量， 但这些方法都建立在各种色素成分及功效都明确的基础之上。 因此， 从成分与功效的关系出发去研究色素的增产， 会使得相关研究更有应用价值。 欲探明色素组分与功效之间的关系， 又回到最初的色素提取、 纯化、表征和功效评估的基础研究上。 相信随着相关技术的发展， 红曲色素产业能够不断降低成本、 提高功效， 实现产业飞跃发展。