厦门水产品中河弧菌的调查分析

翁琴云

（厦门市食品药品质量检验研究院，福建厦门 361012）

河弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌，广泛分布于海水、河水环境以及海洋动物的体内，不仅对水产品产生严重的危害，还会引起人类急性肠胃炎以及肠道外感染[1-2]，在全球范围内引起腹泻的散发与暴发流行事件中，河弧菌在致病性弧菌中的检出率仅次于霍乱弧菌和副溶血性弧菌，而且河弧菌介导的感染经常发生在大量消费水产品的地区，是一种具有流行潜力的食源性病原菌[3-4]。我国食源性疾病暴发系统监测资料显示，河弧菌已导致一部分食源性疾病的发生[5-6]。厦门地处沿海，人们日常的饮食离不开水产品，而且随着经济发展，人均水产品消费呈现快速上升势头。因此，加强水产品中河弧菌监测并研究其毒力基因的分布及耐药情况对食源性疾病事件的预防以及控制具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

从厦门市零售店、超市、农贸市场等场所采集了210 份水产品，包括淡水鱼、海水鱼以及贝类水产品。

1.1.2 试剂

3%碱性蛋白胨水、TCBS 琼脂、3%氯化钠三糖铁琼脂（北京陆桥生物科技有限公司）；弧菌显色培养基（法国科玛嘉公司）；API 20E 试剂盒（法国梅里埃公司）；河弧菌核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）（深圳生科原生物有限公司）；革兰氏阴性细菌药敏卡AST-GN09（法国梅里埃公司）；常规PCR 以及电泳相关试剂（上海生工生物工程有限公司）。

1.1.3 引物

参考已有文献[7-8]，委托上海生工生物有限公司合成河弧菌毒力相关基因vfh、hupO、vfp和toxR的扩增引物，引物序列见表1。

表1 河弧菌毒力基因PCR 检测的引物序列

1.2 仪器

GNP-9160 隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；CFX96 Touch 实时荧光PCR 仪（美国伯乐公司）、Powerpac 琼脂糖电泳仪（美国伯乐公司）、Gel doc XR 凝胶成像仪（美国伯乐公司）；VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 河弧菌的检测

河弧菌的检测主要依据美国食品和药品管理局发布的细菌分析学手册（BAM）第九章弧菌的方法进行检测，并在增菌环节以及鉴定环节增加河弧菌荧光PCR 方法检测。

1.3.2 制备DNA 模板

用菌环挑取单菌落于500 µL 无菌去离子水，99 裂解5 min，12 000 r·min-1离心2 min（离心半径为5 cm）后取上清。

1.3.3 药敏试验

按照革兰氏阴性细菌药敏卡AST-GN09 试剂盒说明书进行检测。

1.3.4 数据分析应用SPSS 23 对数据进行分析，弧菌检出率组间差异用χ2检验，p＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水产品中河弧菌的检测结果分析

由表2 可知，210 份水产品中，有57 份检出河弧菌，共分离得到57 株分离株（一份样品只保存一株），河弧菌总检出率为27.14%。其中，贝类水产品检出率最高，经过比较，只有贝类水产品与淡水鱼存在显著性差异（χ2=5.59，p＜0.05），贝类与海水鱼，海水鱼与淡水鱼不存在显著性差异。

表2 水产品中河弧菌检测结果

2.2 毒力基因分析

由图1 知，57 株河弧菌均携带vfh和toxR基因，其中有44 株携带vfp基因（77.19%）；46 株携带hupO基因（80.70%）。分析各毒力基因的分布情况：同时携带4 种基因（毒力基因类型为vfh+hupO+vfp+toxR+）的河弧菌居多（71.93%），vfh+vfp+hupO-toxR+基因型最少，只有3 株（5.26%）。7 株从淡水鱼中分离得到的菌株全部都是vfh+vfp+hupO+toxR+型，其他类别的水产品中分离株在4 个型别中有不同程度的分布，详见图1。

图1 河弧菌在不同类水产品中的基因分布情况

2.3 耐药性分析

由表3 可知，相对于其他抗生素，河弧菌对临床上常用的抗生素氨苄西林、头孢唑林以及复方新诺明呈现较突出的耐药性，耐药率分别是12.28%、10.53%以及8.77%；对于哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛以及头孢呋辛酯分别有不同程度的耐药，对于其余14 种抗生素均为敏感；进一步研究表明，对2 类及3 类抗生素呈现耐药性的有12 株（21.05%），其中有1 株来源于油蛤的菌株（毒力基因类型为vfh+hupO+vfp+toxR+同时对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、复方新诺明等3 类抗生素耐药）。

表3 57 株河弧菌耐药情况

3 结论与讨论

厦门市水产品中河弧菌检出率为27.14%，总体上高于其他地区[9-11]的检测结果。这除了与样品类别、采样时间、采样区域等因素有关外，还与检测方法相关。本研究在常规培养的基础上，样品经增菌液增菌后先运用荧光PCR对增菌液进行快速筛查，PCR 结果为阳性的增菌液接种于TCBS 以及弧菌显色培养基，经培养后再挑取可疑菌落进行鉴定，PCR结果为阴性的样品则直接判定为未检出河弧菌。在检测步骤中加入PCR 方法有助于对平板划线结果的准确判断，有助于提高检测效率。另外，本研究的结果显示淡水鱼中存在着一定程度的河弧菌污染（检出率为14.58%），而且与海水鱼的检测率不存在显著性差异，分析原因，可能是淡水养殖水体存在污染[12]，也可能是因为农贸市场、超市等部分销售场所环境复杂，储藏条件不当，比如存在海水鱼、淡水鱼混养的现象等都有可能造成交叉污染。

河弧菌可以产生类肠毒素物质、细胞毒素、金属蛋白酶和溶血素等多种与致病相关的毒力因子，目前从河弧菌中分离得到的主要毒力基因包括溶血素（vfh）、亚铁血红素利用蛋白（hupO）、金属蛋白酶（vfp）和毒力基因调控蛋白（toxR），它们在致病过程中发挥着不同的作用，与河弧菌致病性紧密相关。本研究从水产品中分离得到的57 株河弧菌均携带vfh和toxR基因，vfp、hupO基因携带率分别为77.19%以及80.70%。与本研究结果相似，张晶等[11]在从水产品分离得到15 株河弧菌vfh和toxR基因的携带率均为100.0%，hupO以及vfp基因的携带率分别为60.0%及80.0%；周妍妍等[13]报道临床分离的9 株河流弧菌均携带vfh和toxR基因，而hupO的携带率为77.8%，vfp的携带率为44.44%。这4 种毒力基因广泛分布于河弧菌临床以及水产品分离株中。

近年来，随着抗生素的广泛使用，河弧菌的耐药性问题也越来越严重，尤其是多重耐药菌株的出现令人十分担忧。LIANG 等[7]报道44 株来源于海产品以及临床河弧菌分离株对氨苄西林、阿奇霉素、磺胺甲基异恶唑和阿莫西林/棒酸的耐药情况比较突出，27.3%的菌株表现出多耐药性。本研究从水产品中分离得到的河弧菌分离株有20 株（35.09%）对抗生素产生不同程度的耐药，对氨苄西林、头孢唑林以及复方新诺明的耐药率分别达到12.28%、10.53%以及8.77%。水产品中的河弧菌呈现不同程度的耐药性，给水产品以及人类健康带来了潜在的安全隐患。

综上所述，在厦门市水产品中河弧菌存在较高程度的污染以及多种毒力基因的检出、耐药菌株的存在，提示河弧菌给厦门市水产品带来一定的食品安全风险，对消费者的健康构成潜在威胁，应当引起相关部门的重视，未来需加强对水产品中河弧菌的监测。但目前关于河弧菌的检测，尚未有河弧菌的国家标准方法可以参考，后续研究中，可以通过优化增菌、选择性培养基条件等来提高河弧菌的检测效率，从而为加强河弧菌连续监测提供技术支持。另外，在本研究的基础上可以深入开展更多关于河弧菌的研究，比如筛选更多的毒力基因，研究毒力基因的表达，筛选耐药基因、探索河弧菌的耐药性与致病机制之间的关系等，为河弧菌的监测及防控提供科学依据。