等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假

段真文，许绍坤，张 薇，李鲜鲜，董文玥

（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）

随着肉类价格差异逐步拉大，以次充好的现象时有发生，这种行为不仅损害消费者的权益和健康，还会扰乱市场经济[1]。加强肉类食品的监督管理，除了制定一系列政策、法规制度外[2]，还需要可靠的检测方法。现阶段羊肉掺假鉴定的方法有很多，主要有传统感官鉴别方法和常规PCR 方法[3]。传统感官鉴别方法是人们根据生活经验对肉类食品性状进行鉴别。因肉制品中蛋白质的干扰因素多变性、DNA的高温稳定性和高度守恒，常规PCR 检测方法更具优势，应用范围也更广[4]。但是常规PCR 检测方法需要专业的检测人员，对仪器设备的要求高，整个检测系统的移动性差，成本高，难以满足食品新鲜度现场实时检测的要求。

等温扩增荧光检测方法是核酸体外快速扩增与荧光检测方法融合的新型核酸诊断POCT 方法，针对目的片段多个区域设计4 ～6 条特异引物，通过添加荧光染料实时监控整个扩增过程，可以兼容实验室或现场检测。与普通PCR 技术相比优化了实验操作、缩短了检测时间。本研究建立的快速鉴定羊肉掺假的等温扩增荧光检测方法解决了传统的核酸检测方法无法现场化、快速化鉴定羊肉掺假的问题，为羊肉掺假鉴定提供了一种快速准确的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜羊肉来自超市购买的样本、Isothermal Mastermix、氢氧化钾。

1.2 实验仪器

等温扩增荧光检测仪、移液器、恒温金属浴、旋涡振荡仪、台式高速冷冻离心机、DT-PRIME 和超微量紫外分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取

（1）样本预处理。用一次性手术刀片在肉内部取样（约3 mm×3 mm），将样本放置在一次性培养皿中，再用刀片将样本切碎，便于提取DNA。

（2）样本提取DNA。将处理好的羊肉样本放入装有1 mL 0.3 mol·L-1KOH 溶液的离心管中，手动摇匀使样本完全浸没在溶液中后，再放入95 的恒温金属浴中加热10 min，加热结束后冷却静置至室温5 min，即得到样本的DNA，取200 µL 上清液保存备用，DNA 浓度为554 ng·µL-1。

1.3.2 等温扩增荧光检测方法的建立及优化

（1）等温扩增荧光检测方法的初建立。通过查询资料，初步确定反应体系为Isothermal Mastermix 15 µL；FIP、BIP、F3、B3、LF 和LB 各1 µL；样本1 µL；加3 µL 水补齐至25 µL。扩增程序为65 ，50 min；熔解程序为98 ～80 ，0.05 ·s-1；通过分析扩增曲线和熔解曲线判断实验结果。

（2）引物组设计。针对羊的线粒体序列保守区域分别设计2 套引物组，使用GenBank 数据库下载全序列，使用BLAST 软件进行序列比对，并通过Lamp Designer 引物设计软件进行引物设计，详细信息见表1。

表1 LAMP 特异性引物序列

（3）引物筛选。取适量样本，对羊的两套引物组进行筛选，通过特异性、灵敏度实验筛选出引物效率高且扩增稳定的引物组，最优引物组是SP-1。

（4）引物组工作浓度配比的优化。将羊引物组的F3、B3 稀 释 成5 pmol；FIP、BIP 分 别 稀 释 成40 pmol、10 pmol、5 pmol；LF、LB 分别稀释成50 pmol、20 pmol、5 pmol。F3、B3 和FIP、BIP 和FIP、BIP 各取等量按照1 ∶8 ∶4、1 ∶2 ∶1、1 ∶5 ∶10 的比例进行混合。按照反应体系，使用3 组不同引物组工作浓度配比进行扩增，扩增程序为65 ，30 min。

（5）反应条件优化。确定最佳引物组工作浓度配比后，按照反应体系对羊肉样本进行反应温度的探索试验，根据反应温度梯度设置的原则，设置8 个温度梯度，反应温度以64.5 为中间温度，反应温度为61 ～68 ，扩增时间为30 min；熔解程序为98 ～80 ，0.05 ·s-1；通过分析扩增曲线和熔解曲线判断实验结果。

（6）特异性实验。按照优化后的引物配比和反应温度，使用羊肉的引物对鸡、猪、牛、羊提取的核酸样本进行检验。

（7）灵敏度试验。将羊肉核酸样本用ddH2O 按照10 倍倍比进行稀释至10-10，设置一个阴性对照，检测最低检测限。

2 结果与分析

2.1 等温扩增荧光检测方法的初建立

对查阅到的初步确定体系进行验证，羊肉出峰时间为11.83 min，熔解温度为84.83 ，确定反应体系25 µL 总 体 系Isothermal Mastermix 15 µL；FIP、BIP、F3、B3、LF 和LB 各1 µL；样本1 µL；加3 µL水补齐至25 µL。

2.2 等温扩增荧光检测方法的优化

2.2.1 引物组工作浓度配比的优化

将第1 孔中加入阴性对照，第2—4 孔中加入羊的DNA 样本。其中第2、3、4 孔中引物组配比分别为1 ∶8 ∶4、1 ∶2 ∶1、1 ∶1 ∶10。结合扩增曲线和熔解曲线分析，羊最佳引物组工作浓度配比为1 ∶8 ∶4，该配比条件下出峰最快，有特定的熔解温度，其余引物组配比在30 min 内没有出峰，对样本的扩增效率不太理想。

2.2.2 反应条件优化

对羊肉DNA 样本进行反应温度的摸索试验，设置8 个温度梯度，反应温度以64.5 为中间温度，羊的DNA 样本在65 时扩增最快，扩增时间为12.23 min，溶解温度为84.52 。其余反应温度的扩增效果均没有65 时好。

2.2.3 特异性实验的结果

检测羊肉中是否含有其他肉类成分，1—4 号孔中分别加入羊肉的特异性引物，加入鸡、猪、牛、羊肉DNA 样本进行扩增，结果见图1、图2。从实验结果中可以看出只有第一个孔出现标准“S”型的扩增曲线并有特异的熔解温度，即在羊肉样本中只检测出羊肉成分，未检出其他肉类成分。

图1 扩增曲线

图2 熔解曲线

2.2.4 灵敏度实验的结果

最低检出限为5.54×10-5ng·µL-1，样本浓度达到该浓度均起峰，出现阳性结果；若样本浓度低于此浓度，则不会出现扩增曲线，可能是因为样本量不足，荧光值过低检测不到扩增过程。

3 讨论

3.1 引物组工作浓度配比及反应温度的优化

反应温度和引物组工作浓度配比会影响等温扩增荧光法的扩增效果。引物浓度过低，可能会导致产物的荧光值过低仪器难以监测，降低产率；引物浓度过高，可能会引起错配和非特异性扩增，增加引物二聚体的风险。在合适的范围内，改变引物浓度配比可以增加反应的扩增效率和稳定性[5]，提高反应的灵敏度。

3.2 引物特异性和灵敏度

本研究针对羊线粒体的Cytb 基因设计引物，通过验证发现该方法具有良好的特异性。羊的特异性引物只扩增该样本，对提取的样本DNA 进行稀释可检测到稀释倍数的7 倍。选取的样本只是该肉类种属的新鲜样本，未掺入其他肉类，实验结果可靠。

4 结论

本研究采用直扩法简化样本处理步骤，以等温扩增荧光法快速鉴定羊肉种属和掺假，结果准确可靠且具有良好的特异性和灵敏度。该方法使样本的检测更加快速，可在30 min 内检测出实验结果，同时满足实验室检测和现场检测要求，实现肉制品现场化检验，为肉制品种属鉴定提供新的方法。