金黄色葡萄球菌耐药机制研究进展

李萍，许红霞，孟葆林，曹旭东

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌，staphylococcus aureus,SA)是一种广泛存在于自然界、人体的化脓性病原菌，也是常见的与社区、医院获得性疾病相关的病原体。金葡菌侵入机体后产生多种毒素和毒力因子，逃避机体免疫系统的防御，引起局部和全身的浸润性感染[1]。β-内酰胺、大环内酯类等药物是治疗金葡菌感染的常用抗生素，金葡菌对这些抗生素的耐药性迅速增加，多种耐药基因在金葡菌分离株中被频繁报道，已被WHO确定为全球关注的重要问题。金葡菌的耐药性除与相关的结合蛋白、基因表达调控等有关外，还与其黏附能力有关，由金葡菌引起的慢性生物膜相关感染通常会导致感染率和病死率显著增加[2]。金葡菌对不同种类的抗生素有不同耐药机制，使抗感染的治疗复杂化。本文通过探讨金葡菌耐药机制，以期为金葡菌的致病性研究及治疗提供参考。

1 青霉素结合蛋白(PBP)

1.1 PBP2a 传统的β-内酰胺类抗生素如青霉素、甲氧西林等在金葡菌感染中广泛存在耐药性。β-内酰胺类抗生素中含有β-内酰胺酶，能使青霉素或结构相似的药物失活，介导的耐药性通常是窄谱的，该酶由blaZ基因编码，blaZ基因维持在质粒中[3]。β-内酰胺类抗生素的抗菌活性还能通过与青霉素结合蛋白(PBPs)共价结合，抑制PBP介导的细菌细胞壁合成的转肽酶活性。PBPs是β-内酰胺类抗生素的主要靶点，也是细菌细胞壁生物合成的重要物质，在细菌的分裂期通过调节细胞壁合成发挥关键作用，确保细菌从母代向子代的分离[4]。每个金葡菌菌株均有4个核心基因组编码的PBPs(PBP1～4)，PBP1在金葡菌中主要起转肽酶的作用，PBP3与金葡菌的自溶有关，PBP4与金葡球菌β-内酰胺类耐药有关[5]。PBP2a因其对所有β-内酰胺类药物产生高水平和广谱耐药性而备受关注。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对β-内酰胺类耐药是由PBP2a或PBP2′低亲和力介导所致，其允许细菌在高浓度药物存在下合成细胞壁，PBP2a和PBP2′分别由mecA和mecC基因编码[6]。PBP2a的合成受转录调节因子MecI和信号转导蛋白MecR1的调控，MecI和MecR1基因编码于葡萄球菌染色体盒元件SCCmec/mecA中[7]。MecI和MecR1分别与BlaI和BlaR1具有很高的蛋白序列相似性，可调节PBP2a表达的功能。因此，在MRSA的许多临床分离株中，携带blaI和blaR1基因的质粒可编码调节PBP2a表达的蛋白质[8]。不同金葡菌菌株中出现的耐β-内酰胺类药物模式表明，其潜在的耐药机制是一种普遍的耐药机制[9]。

1.2 PBP4 PBP4是金葡菌中的一种非必需的、低分子量青霉素结合蛋白，研究表明PBP4可介导金葡菌的高水平和广谱β-内酰胺耐药，PBP4可在部分交联的肽聚糖上进行酶活化，以非从头开始的方式修复细菌肽聚糖缺陷，促进细胞壁的稳定性[10]。Basuino等[11]研究显示，在金葡菌菌株中，检测到高频率PBP4启动子突变和围绕PBP4活性位点的错义突变，PBP4启动子突变导致PBP4产生过量，进而促进细菌细胞壁的交联；PBP4的活性是表现高水平β-内酰胺耐药的关键，而PBP4的错义突变及其启动子突变共同促进了β-内酰胺的耐药。Greninger等[12]学者对9种金葡菌子代菌株进行全基因组测序，以确定与第五代头孢菌素类抗生素高度、mecA无关的耐药相关的突变，其中5株来自5个不同亲本菌株的头孢他林耐药株均产生了PBP4启动子突变，而其中4个(80%)与编码PBP4 Asn138残基突变的PBP4单核苷酸多态性相关，结果显示PBP4基因的错义或其启动子的突变与第五代头孢菌素的耐药性密切相关。研究表明，PBP4基因和启动子突变共同对β-内酰胺类药物的耐药性产生协同作用，PBP4与PBP2/2a的相互作用促进了对β-内酰胺类抗生素的耐药性[13]。

2 mecA基因

mecA基因与β-内酰胺类抗生素的耐药性有关，mecA基因广泛分布于多种葡萄球菌中，mecA基因表达受DNA结合蛋白MecI和信号转导子MecR1调控，编码青霉素结合蛋白PBP2a或PBP2′，对许多半合成青霉素(包括甲氧西林、萘菲林和苯唑西林)及大多数头孢烯类药物具有低亲和力，与青霉素酶介导的耐药性不同，mecA引起的耐药性是广谱的[14]。与天然PBPs相比，mecA基因产物通过降低β-内酰胺介导的酶酰化速率和对β-内酰胺的亲和力而产生耐药性。在不同种类的葡萄球菌中已鉴定出mecA1和mecA2两种mecA基因同源型[15]。mecA携带一种可移动的遗传元件SCCmec，SCCmec高度多样，迄今为止已识别出11种类型(I至XI)，它们在大小(从21 kb到67 kb)上存在差异，其抗药性因SCCmec类型而异。该元件在葡萄球菌之间转移，产生广谱β-内酰胺耐药。目前已知的SCCmec元件携带以下常见的基因复合物：orfX(便于SCCmec整合到金葡菌基因组的attB位点序列中)；5类mec盒基因(包括MecA、MecC、MecB及其位于MecA上游的调控蛋白MecR和MecI)；侧翼插入序列元件(IS431和IS1272)；重组酶ccrA、ccrB和ccrC 3个同素型，ccr同素型之间的序列相似性<50%，负责SCCmec的切除和整合；SCCmec还可能包含其他基因结构，如pT181和pUB110，这些结构导致对其他非β-内酰胺类药物产生耐药性；其他重金属和抗生素抗性基因，如ars和blaZ等[16-17]。Greninger等[12]研究表明缺乏mecA基因的金葡菌菌株能发展成高水平的β-内酰胺类抗药性。

3 erm基因

以红霉素为代表的大环内酯类抗生素，通过与50S核糖体亚基的肽基转移酶活性位点结合而抑制蛋白质合成。金葡菌已对长期使用红霉素者产生高度耐药性。金葡菌对红霉素耐药的机制有两点：一是通过erm(红霉素抗性甲基化酶)基因编码介导核糖体靶位点的修饰，二是由msrA/B(大环内酯类特异性耐药基因)和ereA/B(红霉素酯酶)基因编码的依赖ATP的外排泵，其中依赖erm基因编码的甲基转移酶介导核糖体靶点的修饰是大环内酯类抗生素耐药的主要机制[18]。erm基因编码的蛋白质使23S rRNA结构域肽基转移酶区的腺嘌呤残基A2058/2059甲基化，并导致大环内酯、林可酰胺和链球菌素B(MLSB)等抗生素耐药性[19]。erm基因介导的耐药菌株表现出两种表型：组成型MLSB(cMLSB)和诱导型MLSB(iMLSB)，不同表型与不同的分子调控机制有关。在iMLSB株中erm的翻译起始受到抑制，其mRNA核糖体结合位点被红霉素与先导肽结合后隔离，促使mRNA核糖体结合位点释放，限制erm的作用。cMLSB菌株允许诱导转录物的独立翻译，因其先导肽基因序列的变异会消除翻译[20]。Jarajreh等[21]研究发现，金葡菌对红霉素、克林霉素的耐药性主要是由ermA或ermC基因引起的。ermA是MRSA菌株中最常见的基因，位于转座子Tn554上，能插入金葡菌染色体的不同区域；ermC是导致金葡菌菌株中大环内酯类耐药的最常见基因，由质粒携带。在金葡菌中还发现了ermB、ermF、ermY和lunA等对大环内酯类林可酰胺类和链霉素耐药的基因[22]，表明大环内酯类的一种或几种新的耐药机制可能在金葡菌中广泛存在。

4 tetM和tetK基因

四环素类药物主要通过阻止氨基酰tRNA进入核糖体而抑制细菌蛋白质合成。金葡菌对四环素类药物的耐药机制主要有两种：由质粒编码的tetK和tetL基因介导的主动外排和由染色体或转座子tetM或tetO基因编码的核糖体保护蛋白，保护核糖体免受药物作用[23]。大多数携带tetL的菌株也携带其他四环素抗性基因，如tetM和tetK。tetM和tetK的基因通常位于染色体上的DNA，tetM的耐药性可能与整合和结合转座子相关，促进基因之间水平转移，该元件也可携带编码氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因；tetL基因通常是通过质粒传播的，相应的质粒大小不同，可能携带额外的抗性基因；四环素抗药性基因tetM和tetK与可移动基因元件的结合可能促进抗药性性状在MRSA中的传播[24]。De Vries等[25]研究表明人类来源的金葡菌含有不同的tetM基因，位于Tn916和Tn5801样的结合转座子上；不同动物来源的金葡菌含有一种特定类型的tetM，位于Tn916类元素上，并首次报道Tn5801、Tn6014可在金葡菌分离株之间转移。

5 生物膜的形成

细菌的生物膜基质和表型特征赋予宿主免疫反应和抗菌药物作用的抵抗力，并受多方面和重叠的调控网络的调节，不同的金葡菌菌株的生物膜组成不同，出现具有不同生理特性的药物难治性细胞亚群，并导致难治性细菌感染患者的治疗失败[26]。在金葡菌中，生物膜分离受辅助基因调节器Agr(accessory gene regulator)，被认为是一个在浮游和生物膜状态之间的重要调节开关[27]。其可下调细胞表面相关蛋白的表达，并上调胞外毒素(溶血素、肠毒素)胞外蛋白酶等的表达。Agr介导的生物膜扩散与SspA、SspB、Aur和Scp等胞外蛋白酶的分泌相关[28]。研究发现Agr功能失调的菌株比功能正常的菌株更具耐药性[29]。金葡菌还能以icaADBC编码的多糖细胞间黏附作为生物膜形成的机制，携带ica位点是大多数临床金葡菌菌株的特征，Agr系统的缺失增强了临床MRSA菌株的生物膜形成，Agr位点编码分别由P2和P3启动子驱动的RNAⅡ和RNAⅢ转录体。在人类MRSA分离株中，纤维连接蛋白结合蛋白(FnBPs)被证明是独立于ica的生物膜形成因素，FnBP是一种多功能表面蛋白，由参与纤维粘连蛋白结合的串联重复序列分离。FnBP蛋白FnBPA和FnBPB均参与了医院和社区分离株在静态和流动条件下MRSA生物膜形成的累积阶段[30]。此外，SasG通过SasG蛋白的同质均可促进细胞间聚集，SasG蛋白的重复B结构域促进生物膜形成，B结构域通过在细胞表面形成伸展的纤维，以Zn2+依赖的方式促进独立于ica的生物膜的形成[31]。

6 小 结

金葡菌是临床上常见的病原菌之一，感染后过度、不合理地使用抗生素导致耐药菌株的增加和治疗失败率的增高，对不同种类的抗生素有不同耐药机制，金葡菌菌株中抗生素耐药基因的出现和快速传播给全球公共卫生带来了严重挑战。金葡菌的耐药性与相关的结合蛋白、特异性耐药基因表达调控、抗生素结合位点改变、产生降解或改变抗生素结构的、编码转运蛋白的基因突变、黏附能力等有关，还可能与出现新抵抗力的菌株流行、菌株基因突变、细菌免疫逃逸有关。金葡菌的分子特征因区域而异，其多样的耐药机制使金葡球耐药严重，临床感染治疗复杂化。抗菌药物敏感性和耐药基因分布的研究对医院感染控制具有重要意义。应加强对其耐药性监测，同时根据药敏结果合理选用抗菌药物。此外，结合分子生物学技术鉴定金葡菌毒力因子、克隆复合物和序列类型判断耐药，靶向筛选其抗性表型和相关的抗性基因型可作为评价金葡菌抗性的重要参考。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。