血流感染和皮肤软组织感染金黄色葡萄球菌耐药特征及多位点序列分型

温伟洪， 徐令清， 李玉珍， 李介华， 汤英贤， 黄延峰

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是医院感染与社区感染重要致病菌之一，可引起毒素性疾病和化脓性感染，常见于皮肤软组织感染和血流感染。近年社区相关MRSA（community associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，CAMRSA）以及牲畜相关MRSA（livestock associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，LAMRSA）的出现使MRSA防治形势更为严峻。了解金葡菌耐药特征，可为临床经验用药提供参考依据，减少抗生素不合理使用。金葡菌多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是基于对其7个管家基因测序的分子分型方法之一。管家基因高度保守，变化积累缓慢，因此金葡菌MLST主要用于了解菌株遗传背景、起源和进化，其优势在于具有高分型率及高重现性，不同实验室数据可比对，缺点是分辨能力相对较低[1]。为了协助临床更好对金葡菌感染防治，本文对本院血流和皮肤软组织感染金葡菌耐药性及MLST特征进行分析，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 本院微生物室于2015年8月－2016年7月自门诊和住院患者血培养样本分离出金葡菌47株，自脓液或抽吸物样本分离出金葡菌62株，剔除同一患者重复分离株，共109株金葡菌。其中47例血培养金葡菌分离株的患者因均有发热和寒战症状，体温≥38 ℃，经临床确诊为血流感染。脓液或抽吸物培养出金葡菌的62例患者相应部位均有红、肿等皮肤炎症表现，经临床确诊为皮肤软组织感染。质控菌株为金葡菌ATCC 25923。

1.1.2 主要仪器和试剂 BD PhoenixTM100全自动细菌鉴定药敏系统、复合鉴定板（美国BD公司），细菌DNA提取试剂盒（Magen公司），重组溶葡萄球菌酶（上海生工），实时荧光定量PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 金葡菌鉴定及药敏检测 采用BD PhoenixTM100全自动细菌鉴定药敏系统进行金葡菌鉴定及药敏检测，药敏判断标准参照2016 CLSI M100-S26药敏试验指南。夫西地酸药敏判断标准参照EUCAST药敏试验指南，MIC≤1 mg/L为敏感，MIC≥2 mg/L为耐药。MRSA判断标准：金葡菌头孢西丁MIC≥8 mg/L或苯唑西林MIC≥4 mg/L。金葡菌高水平莫匹罗星耐药判断标准：莫匹罗星MIC≥512 mg/L。

1.2.2 医院相关MRSA（hospital associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，HAMRSA）、CA-MRSA判断标准 按照卫生部制定的医院感染诊断标准，患者入院48 h后获得感染并分离的MRSA判断为HA-MRSA。门诊患者或入院48 h内获得感染并分离的MRSA且患者1年内无医疗结构接触史、无留置导管或医疗装置判断为CAMRSA[2]。

1.2.3 金葡菌MLST分型 按照MLST官网（http://saureus.mlst.net/）提供的引物序列、PCR反应条件、反应体系扩增金葡菌7个管家基因（arcC、aroE、glpF、

gmk、pta、tpi、yqiL），扩增产物送广州劢致生物科技有限公司测序，测序结果与MLST官网数据库进行比对获得金葡菌序列型（sequence type，ST）。7个管家基因中6个相同定义为同一克隆复合体（clone complex，CC），两种ST在单个位点不同定义为单位点变异体（single locus variant，SLV）。

1.2.4 统计分析 应用WHONET 5.6软件统计细菌耐药率，应用SPSS 19.0软件分析血流感染与皮肤软组织感染金葡菌中MRSA检出率差异，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血流感染与皮肤软组织感染金葡菌耐药特征

血流和皮肤软组织感染MRSA检出率分别为21.3%和61.3%（10/47和38/62），两者差异有统计学意义。未发现高水平莫匹罗星耐药金葡菌，对非β内酰胺类抗菌药物耐药率和敏感率见表1。

2.2 血流感染金葡菌MLST结果

47株血流感染金葡菌共获得18种ST，新型ST占10.6%（5/47）。ST965与ST5、ST630与ST239、ST338与ST59有一个位点不同，分别属CC5、CC8、CC59，其他ST之间无遗传相关性。10株MRSA含5种ST，最常见为ST59（40.0%，4/10），其次为ST45、ST188、ST239、ST338各1株；37株MSSA含16种ST，以ST7、ST188为主（各16.2%，6/37），其次为ST15（10.8%，4/37），见表2。

表1 血流和皮肤软组织感染金葡菌对抗菌药物耐药率和敏感率Table 1 Susceptibility of the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection and skin and soft tissue infection to antimicobial agents

表2 血流感染金葡菌MLST分型Table 2 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection

表2 （续）Table 2（continued）

2.3 皮肤软组织感染金葡菌MLST结果

62株皮肤软组织感染金葡菌共获得18种ST，新型ST占12.9%（8/62）。ST965与ST5，ST630与ST239，ST338、ST3188与ST59有一个位点不同，分别属CC5、CC8、CC59，其他ST之间无遗传相关性。38株MRSA含11种ST，最常见为ST338（47.4%，18/38），其次为ST59（13.2%，5/38）；24株MSSA含12种ST，以ST5、ST88为主（各12.5%，3/24），其次为ST7、ST188、ST398各2株，见表3。

表3 皮肤软组织感染金葡菌MLST分型Table 3 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with skin and soft tissue infection

3 讨论

MRSA对所有传统β内酰胺类抗菌药物耐药（青霉素类、第一至第四代头孢菌素、碳青霉烯类抗菌药物），其主要的耐药机制为mecA基因或mecC基因介导的甲氧西林耐药，2014－2016年CHINET细菌耐药监测网数据显示MRSA平均检出率分别为44.6%、42.2%、38.4%[3-5]。本组资料结果显示血流感染MRSA检出率为21.3%，低于近年CHINET细菌耐药监测网报道MRSA平均检出率。研究报道MSSA相对MRSA毒力基因携带率更高[6-7]，提示我们关注MRSA的同时，不能轻视MSSA感染。皮肤软组织感染MRSA检出率为61.3%，高于近年CHINET细菌耐药监测网报道MRSA平均检出率，提示皮肤软组织感染金葡菌可能存在MRSA克隆株流行。

本组资料结果显示血流感染和皮肤软组织感染金葡菌对非β内酰胺类抗菌药物有较高耐药率的依次为红霉素、克林霉素、四环素，其中克林霉素常推荐用于治疗金葡菌引起的皮肤软组织感染，而皮肤软组织感染MRSA株和MSSA株对克林霉素耐药率为分别为86.8%和29.2%，提示临床克林霉素仅可经验用于治疗皮肤软组织MSSA感染。对非β内酰类抗菌药物包括庆大霉素、环丙沙星、利福平、甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率均≤30.0%，其中庆大霉素和利福平主要与敏感抗菌药物联合使用。对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁、夫西地酸、高水平莫匹罗星耐药率均为0，提示这些抗菌药物可作为临床治疗金葡菌感染经验用药。

金葡菌MLST结果显示血流感染MRSA株共有5种ST，文献报道血流感染MRSA株优势ST为ST239、ST5[8-9]，本组资料最常见为ST59（4/10，40.0%），其次为ST45、ST188、ST239、ST338各1株；MSSA株共有16种ST，每种ST不超20%，最常见为ST7、ST188（各16.2%，6/37）。皮肤软组织感染MRSA株共有11种ST，文献报道皮肤软组织感染MRSA株优势ST为ST59[10-11]，本组资料最常见为ST338（18/38，47.4%），其次为ST59（13.2%，5/38）；MSSA株共有12种ST，每种ST不超15%，最常见为ST5、ST88（各12.5%，3/24）。上述结果表明血流感染和皮肤软组织感染MRSA株存在较明显优势ST，而MSSA株ST呈多样化分布。LA-MRSA或LA-MSSA多属于ST398[12-13]，本组资料结果显示ST398金葡菌检出率为4.6%（5/109），其中为血流感染MSSA 1株，皮肤软组织感染MRSA与MSSA各2株，本地区农业人口较多，牲畜业较发达，因此需密切监测ST398金葡菌的流行。近年有关CA-MRSA报道愈来愈多，CA-MRSA与HA-MRSA相比毒力更强[14]，能引起健康人群感染，因此CA-MRSA备受关注。研究发现CA-MRSA可侵入医院引起医院感染，而HA-MRSA可扩散至社区[15-17]，本组资料血流感染和皮肤软组织感染MRSA株MLST分型结果显示，医院和社区血流感染MRSA株中均检出ST59型MRSA；医院和社区皮肤软组织感染MRSA株中均检出ST45及ST338型，可见社区和医院的遗传背景愈来愈复杂，MRSA防控形式不容乐观，相关部门应采取严格防控措施，避免医院与社区之间高耐药、高毒力的MRSA交叉传播。

本组资料结果显示109株金葡菌MLST结果中ST338最常见（19.3%，21/109），其次是ST59（11.9%，13/109），ST338为ST59的SLV，同属CC59。90.5%（19/21）ST338金葡菌分离自皮肤软组织感染，而53.8%（7/13）ST59金葡菌分离自血流感染，46.2%（6/13）ST59金葡菌分离自皮肤软组织感染，ST59金葡菌进化到ST338金葡菌后是否产生毒力改变导致感染谱差异以及ST338金葡菌在皮肤软组织感染流行机制有待日后研究。