凯氏定氮法检测乳制品中蛋白质含量的优化方法

2023-03-14黄漫蓉宋艳梅范光彩钱成林夏忠悦

中国乳业 2023年2期

黄漫蓉，宋艳梅，范光彩，周欢，钱成林*，夏忠悦，2

1 新希望乳业股份有限公司，四川成都 610023 2 乳品营养与功能四川省重点试验室，四川成都 610023

0 引言

蛋白质是乳制品的主要营养成分之一，是衡量乳制品质量的一项重要指标[1，2]。目前检测乳制品中蛋白质的常见方法有凯氏定氮法、分光光度法、燃烧法、红外光谱法、双缩尿法、甲醛滴定法、考马斯亮蓝法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。但是从检测结果的准确性、及时性和检测过程的安全性考虑，分光光度法和甲醛滴定法干扰物质较多，准确性差；燃烧法不能区分蛋白氮和非蛋白氮；红外光谱法需要定期校准，检测成分单一；双缩尿法灵敏度差；精密度差；高效液相色谱-质谱联用法和毛细管电泳法所需要的检测仪器操作复杂，需要检测人员具备一定的专业技能[3～8]。

凯氏定氮法是一种比较常见的检测方法，与其他方法相比较，凯氏定氮法最适宜用来检测乳制品中蛋白质含量，检测结果准确性较高，仪器操作简单，使用者能快速掌握仪器的使用方法[9，10]。该方法主要步骤在消化和蒸馏，其中消化花费的时间最长，检测时的样品称样量也各不相同，因此本文主要对凯氏定氮法检测乳制品蛋白质含量的过程进行优化，以能更好地开展检测工作。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

澳特兰纯牛奶（灭菌乳）、新希望草莓味奶（调制乳）、悠质原味风味酸奶（发酵乳）、饭后半小时果蔬乳酸菌饮品（乳饮料），新希望乳业股份有限公司。

硫酸（优级纯），成都市科隆化学品有限公司；蛋白质催化剂片（硫酸铜+硫酸钾），福斯华（北京）科技贸易有限公司；0.05 mol/L硫酸标准溶液（SRM），深圳市博林达科技有限公司；硼酸（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；溴甲酚绿（指示剂），成都市科隆化学品有限公司；甲基红（指示剂），成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

KjeltecTM 8400全自动凯氏定氮仪、LabtecTM Line 消化炉，福斯华（北京）科贸有限公司；电子天平（感量：0.1 mg），梅特勒-托利多仪器公司；UPR-Ⅱ-20L 纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂配制

1 g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.1 g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。

1 g/L甲基红乙醇溶液：称取0.1 g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。

10 g/L硼酸溶液：称取10 g硼酸，加超纯水溶解并稀释至1 000 mL，加入7 mL甲基红乙醇溶液，10 mL溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀，取30 mL配制好的硼酸溶液加100 mL纯水，颜色呈浅灰色，若偏红则用0.1 mol/LNaOH调节，若偏绿则用0.1 mol/L的HCl调节。

400 g/L氢氧化钠溶液：称取400 g固体氢氧化钠，加水溶解后放冷，并稀释至1 000 mL。

1.3.2 样品检测

称取混合均匀的一定量样品（精确至0.000 1 g）至250 mL消化管中，放入1 粒蛋白质催化剂，加入12 mL浓硫酸，混匀后于消化炉上消化，设置消化时间及消化温度，待消化结束时消化管中的液体呈绿色透明状，取出待冷却至室温，于全自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程[11]。

1.3.3 蒸馏条件

使用全自动凯氏定氮仪，蒸馏条件设置为：稀释液（超纯水）70 mL、碱液（400 g/L氢氧化钠溶液）60 mL、接收液（10 g/L硼酸溶液）30 mL。

1.3.4 优化方案

（1）分别称取灭菌乳、调制乳、发酵乳、乳饮料各1 g、2 g、3 g、4 g、5 g，试样在相同条件消化蒸馏，比对不同的称样量对检测结果的影响。

（2）称取同一质量的灭菌乳、调制乳、发酵乳、乳饮料，比对不同的消化时间（40 min、60 min、80 min、100 min、150 min）对检测结果的影响。

（3）消化后的样品及时冷却一段时间后再使用凯氏定氮仪蒸馏滴定，比对不同的冷却时间（0.5 h、4 h、24 h、48 h）对检测结果的影响。

2 结果与分析

2.1 称样量优化

称取灭菌乳、发酵乳、调制乳、乳饮料不同的称样量进行平行试验，结果如表1所示，对于混合均匀的乳制品，一定范围内称样量对结果的影响不大，精密度均符合《GB 5009.5—2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的要求，但是灭菌乳、调制乳、饮料称样量增多，精密度对应越好，发酵乳则称样量过多后精密度有所下降。