褪黑素单克隆抗体的制备

武海新，廖晨星，常 毅，马 慧，刘巧香，李有志，郭 刚*，刘国世*

1 北京市中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193 2 北京首农食品集团有限公司，北京 100028 3 山东省饲料兽药质量检验中心，山东济南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT）又称为抑黑素或美拉酮宁，哺乳动物体内由松果体释放，广泛存在与消化道、生殖系统、循环系统等部位，调节动物的昼夜节律，同时也具有调节免疫功能[1]、抗衰老[2]、抗肿瘤[3]、调节骨骼生长[4]等广泛的生物学作用。本研究采用动物免疫、制备杂交瘤细胞的方法，制备高特异性褪黑素单克隆抗体。以该褪黑素单克隆抗体为材料，能够进一步开发褪黑素快速检测方法，为生物和畜牧领域的科研和生产提供便利。同时该抗体可作为进一步研究褪黑素体内外功能及机理的材料工具，为后续的科研工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c小鼠[6～8 周龄，（18±2）g]，扬州大学提供；褪黑素（CAS号：73-31-4）、卵清白蛋白（OVA）、EDC、NHS、弗氏佐剂，Sigma公司；羊抗鼠-HRP，南京钟鼎生物公司；透析袋、0.22 μm无菌滤器，Millipore公司；高糖DMEM培养基，Gibco公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒，南京诺唯赞公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制备

将10 mg褪黑素溶解于NaOH水溶液，加热反应6 h，加入盐酸中和过量碱，过硅胶层析柱纯化，得到产物8 mg，溶于200 μLDMF中。称取BSA和OVA各10 mg分别溶于2 mL 0.01 mol/L PBS中，将100 μL衍生物滴加到OVA中，然后各加入10 mgEDC、10 mgNHS，室温搅拌5 h，PBS透析3 天，期间换液6次，取出分装备用。

1.2.2 动物免疫

选取6～8 周龄BALB/c小鼠5 只，将褪黑素-OVA与弗氏佐剂混合，50 μg/只进行皮下注射，2～3 周后加强免疫。采血，通过间接ELISA方法确定抗血清针对褪黑素-OVA的滴度。

1.2.3 抗血清滴度检测及筛选

将褪黑素-OVA用PBS包被液稀释成1 μg/mL，混匀后加入酶标板中，每孔100 μL，4 ℃过夜；丢弃包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37 ℃恒温箱1 h；取出酶标板，弃去包被液，洗板1次；将抗血清从1∶500起3 倍梯度稀释，每孔加入100 μL，37 ℃恒温箱1 h；将液体丢弃，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀释好的酶标二抗（山羊抗鼠-HRP，1∶20 000）；37 ℃恒温箱1 h；将液体丢弃，洗板4次，每孔加入100 μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37 ℃，15 min；每孔加入100 μL 1 mol/L HCL溶液，终止反应；即刻在酶标仪上读数，450 nm处样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。

1.2.4 骨髓瘤细胞制备

提前1 周用含有10%FBS的DMEM培养基将SP2/0细胞扩大培养。细胞融合当天将SP2/0细胞移入50 mL离心管中，离心1 500 r/min，5 min；丢弃上清，加入DMEM基础培养基，吹打细胞并计数。

1.2.5 脾细胞制备

选择血清ELISA滴度达到1∶121 500的小鼠，在融合前3 天终止免疫，腹腔注射褪黑素-OVA 100 μg；融合当天将小鼠进行安乐死处死；在75%酒精中浸泡5 min；在无菌条件下取出脾脏，把脾脏放入培养皿中的DMEM基础培养基中；使用注射器内心研磨脾脏，并用细胞筛过滤，然后用DMEM冲洗筛网。将过滤后悬液转移至50 mL离心管，用不含血清的DMEM清洗1次，离心1 500 r/min，5 min；用红细胞裂解液去除红细胞，用不含血清的DMEM再清洗1次，离心1 500 r/min，5 min；铺板计数。

1.2.6 细胞融合

将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，使脾细胞与骨髓瘤细胞数量比为2∶1；将细胞移至50 mL离心管中，用DMEM基础培养基稀释，离心1 500 r/min，5 min，弃去上清，摇动离心管使细胞均匀；用电融合液洗细胞1次，然后离心1 500 r/min，5 min，弃上清；用电融合液将细胞稀释成2×107个/mL，然后在融合池中加入2 mL细胞悬液进行电融合上机试验，电击后静置10 min；使用高糖DMEM培养基，把融合好的细胞铺至96 孔板，每孔100 μL；将96孔板放于CO2培养箱中培养；10 天后进行融合筛选检测。

1.2.7 融合筛选

将褪黑素-OVA用PBS包被液稀释成1 μg/mL，混匀后加入酶标板中，每孔100 μL，4 ℃过夜。次日吸取100 μL/孔细胞上清进行ELISA检测；根据ELISA结果，样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔；对二次确认后的阳性孔细胞进行亚克隆。

1.2.8 细胞亚克隆

吹打阳性孔细胞并计数，使用有限稀释法对融合细胞进行稀释，并接种至96孔板。7～10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔并做好标记，挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，重复至检测达100%阳性后，挑出单克隆孔进行扩大培养并冻存。

1.2.9 亚克隆筛选

操作方法同1.2.7。

1.2.10 抗体纯化

在亲和纯化层析柱中装入Protein A琼脂糖凝胶介质，将3G3D1细胞上清缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，在PBS中进行4 ℃透析过夜，次日进行纯度与浓度测定。

1.2.11 抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体滴度，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定所得抗体浓度。

1.2.12 纯化抗体ELISA滴度检测

操作方法同1.2.3。

1.2.13 抗体纯度鉴定

纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。

2 结果

2.1 免疫小鼠抗血清滴度检测

通过对5 免后鼠抗血清与褪黑素-OVA滴度检测，1#、3#小鼠抗血清针对褪黑素-OVA滴度能够达到121 500，2#、4#、5#小鼠抗血清针对褪黑素-OVA滴度能够达到40 500（表1）。通过竞争ELISA方法确定抗血清针对褪黑素竞争抑制率，3#小鼠抗血清针对褪黑素有竞争性（表2）。

表1 5免后7 天对小鼠血清抗体滴度检测结果

表2 5免后7 天小鼠血清竞争滴度检测结果

2.2 融合细胞筛选

将骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞进行电融合，铺板10 天后进行ELISA筛选检测。通过两轮ELISA筛选，得到5 株OD值高于0.5的融合细胞（1H12、2C5、2C9、3G3、4C11）（表3）。进一步通过ELISA筛选检测，获得1 株针对褪黑素-OVA特异性最高的融合细胞株（3G3）（表4）。

表3 融合细胞ELISA筛选结果

表4 融合细胞上清竞争ELISA筛选结果

2.3 杂交瘤细胞株的建立

将骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合后，经过3 轮细胞亚克隆和ELISA筛选（表5），获得针对褪黑素-OVA具有高特异性的阳性单克隆细胞株5 株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）（图1）。

表5 亚克隆细胞上清竞争ELISA筛选结果

图1 筛选出的阳性杂交瘤细胞

2.4 纯化抗体滴度鉴定

选择3G3D1这株单克隆细胞株进行抗体纯化。经ELISA滴度检测可达1∶64 000，纯化抗体ELISA检测结果如表6所示。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化后抗体进行浓度测定，所得3G3D1-抗体浓度为0.28 mg/mL，体积4 mL。

表6 3G3D1纯化抗体ELISA检测结果

2.5 抗体纯度鉴定

3G3D1纯化抗体SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，出现55 kD、25 kD两个条带，符合IgG重链与轻链分子大小（图2）。

图2 纯化抗体SDS-PAGE分析

3 讨论

褪黑素分子量为232.28 Da。作为一种小分子物质，褪黑素属于半抗原，无法直接刺激动物产生免疫应答从而产生特异性抗体[5]，因此需要先与蛋白载体相结合，才能实现对动物的免疫过程[6]。本研究中将褪黑素小分子与卵清蛋白OVA进行偶联，制备出褪黑素-OVA抗原，并通过5 轮免疫成功得到了血清滴度过关的免疫小鼠，并且分离小鼠脾脏制备杂交瘤细胞。经过筛选共获得5 株阳性杂交瘤细胞，均可稳定分泌褪黑素单克隆抗体。由于3G3D1细胞株对褪黑素-OVA抗原的识别能力最强，因此使用这株细胞进行抗体纯化，最终得到单克隆抗体浓度为0.28 mg/mL，滴度可达1∶64 000。因此本研究成功制备出针对褪黑素小分子物质的高特异性单克隆抗体。

褪黑素是一种哺乳动物体内常见的抗氧化剂和抗炎物质[7]，同时也是调控生殖的重要激素[8]。本研究制备出褪黑素单克隆抗体，为褪黑素含量的快速检测方法的开发提供材料，也为相关功能性研究奠定基础。