基因检测在儿童糖尿病中的研究进展及临床评估

董国庆 黄秒 陆喜燕

南方医科大学附属深圳妇幼保健院儿童内分泌科（广东深圳 518028）

糖尿病是儿童时期第三常见的慢性疾病，是因环境及遗传等多种因素导致的一种代谢紊乱，主要有1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和其它类型糖尿病［1］。单基因型糖尿病作为其它类型糖尿病中的重要组成部分，包括新生儿糖尿病（neonatal diabetes mellitus，NDM）、青少年成人型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young，MODY）、线粒体糖尿病（mitochondria diabetes mellitus，MDM）和综合征相关糖尿病等，约占儿童糖尿病的1% ～6%［2-3］。然而，由于临床表型异质性和缺乏糖尿病家族史，有一部分单基因糖尿病被误诊。近年来，随着二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）及全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）的开展，糖尿病的遗传学基础越来越清楚。本文对儿童糖尿病基因检测相关内容做如下综述。

1 各类儿童糖尿病的遗传学进展

1.1 T1DMT1DM 有关的遗传变异不断被发现，但其机制如何，待进一步研究［4］。GWAS 已经确定了50 多个导致T1DM 发病机制的遗传风险区域，超过60% 的变异影响胰岛β 细胞表达，表明这些基因可能在T1DM 发病机制中起关键作用［5］。最近研究表明，T1DM 遗传风险评分（the type 1 diabetes genetic risk score，T1D-GRS）可筛查T1DM 遗传风险，适用于新生儿［6-7］、成人糖尿病的分类和胰岛自身免疫性疾病［8］。

1.2 T2DM2 型糖尿病是一种复杂的疾病，是遗传、表观遗传和环境因素之间相互作用的结果［9］。自2007年开始进行T2DM-GWAS 研究后已发现约250 个基因组区域与T2DM 易感性相关［10］，其中几个区域出现了基因突变和疾病的因果证据［11］。例如：KCNJ11、WFS1、HNF1A、HNF1B、ABCC8、GLIS3。长链非编码RNA 在T2DM 患者中与胰岛功能相关，并可促进胰岛β 细胞的凋亡［12］。有关多基因结构与T2DM 研究取得了快速进展，但在疾病预测或预防的临床应用很少［10］。

1.3 单基因糖尿病

1.3.1 MODY是指青少年发病的成年型糖尿病，代表了一组临床异质性常染色体显性遗传疾病，由参与β 细胞发育和胰岛素分泌的基因突变引起，是最常见的单基因糖尿病形式［1，13］。目前明确导致MODY 致病基因有14 个，其中GCK、HNF1A及HNF4A 突变在MODY 最常见［14］。MODY 在儿童人群中发病率因国家和地区而异，但以上基因致病突变约占所有MODY 病例的85% ～90%［15］。GCK 基因突变在中国MODY 患者中最为常见，其次是PAX4、FOXM1［16-18］。注意的是，具有MODY样表型的患者中未发现在已知的MODY 基因突变，需考虑是否有其他基因致病突变导致。最近的研究将RFX6 确定为一种新的MODY 基因［19］，WFS1、PPARG 和GLIS3 可作为这些罕见MODY 形式的潜在候选基因［20］。

1.3.2 NDM是指出生后6 个月内发病的糖尿病，非常罕见疾病，发病率为1/10 万～1/40 万，目前发现至少有26 个致病基因［21］，其中编码钾ATP 通道亚单位的基因（KCNJ11、ABCC8），INS 基因与暂时性和永久性NDM 有关，而GCK 基因中的突变主要表现为永久性NDM。

1.3.3 MDM是指线粒体基因突变型和核基因突变型导致的特殊类型糖尿病，占糖尿病总数的3%。到目前为止，总共发现了54 个与不同类型糖尿病相关的mtDNA 突变［22］，其中m.3243A＞G 突变是MDM 中最常见的突变位点，约占所有MDM 的85%，m.3243A＞G 突变携带率高达1∶400。MDM 在儿童期发病较少，主要在成年发现。若儿童期先出现耳聋和发育迟缓（包括智力残疾、自闭症、矮小），后有糖尿病，要注意MDM。特别是在家系内发现糖尿病的传递符合母系遗传，是高度需注意除外MDM［23］。

2 临床基因检测方法选择及应用指征

2.1 临床基因检测方法选择NGS 技术正迅速成为临床实验室对疑似遗传疾病患者的常规临床诊断工具。首选全外显子测序（whole exome sequencing，WES），现在市面上提供的临床外显子测序大部分可检测点突变外，还检测染色体微缺失、编码区的大片段缺失、部分线粒体基因。注意的是，临床医师在选择基因检测前，需结合临床表型筛选感兴趣的基因，并与检测实验室确认感兴趣基因已充分覆盖。经济条件允许，可以做家系全外，可以提高致病基因新发突变的几率。还有一些用全外测序不能检出，例如6q24 暂时性新生儿糖尿病（TNDM）是一类罕见的单基因糖尿病，与染色体6q24 区基因印迹异常有关，需用甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增法（methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MSMLPA）［24］。对于MDM 临床疑诊患者时，首先筛查m.3243 位点，国内部分基因检测公司开展m.3243位点口腔唾液筛查，必要时首取选皮肤组织（皮肤成纤维细胞），其次为血液（淋巴细胞）进行线粒体基因包检测。目前用于mtDNA 突变分析的方法包括WES、线粒体基因包和全基因组测序（wholegenome sequencing，WGS）［25］。WGS 主要用于识别核突变的情况下很有用，但它的检测效率和准确性需要提高［26］。

在进行基因检测前，临床医师需收集完整的临床信息，如人类表型本体（human phenotype ontology，HPO）规范表达，完整的家族史［27］。进行任何基因检测前均需向受检者签署知情同意书，告知详细阅读理解。检测都不能保证100%找到致病原因，基于现有的研究及认识、受送检样本的真实性、检测局限性等因素限制。检测只是辅助临床诊断，不能替代临床诊断。高精度的检测方法仍然面临可能发现一些临床意义未明的结果，做好思想准备。

2.2 临床应用指征对于以下几类糖尿病患儿，建议进行分子遗传学检测［1，13，28］：（1）6 个月龄前发病；（2）6 ～12 个月龄起病，自身抗体阴性；（3）合并胰腺外病变；（4）家族多代（三代以上）高血糖或糖尿病史；（5）诊断T1DM 5年后，胰岛素需要量低，血清及尿C 肽在正常范围或稍偏低；（6）稳定、轻度的空腹血糖升高（5.5 ～8.5 mmol/ L），糖化血红蛋白稳定在5.6% ～7.6%之间，特别是非肥胖患者；（7）新生儿期高胰岛素性低血糖症；（8）与肥胖程度不符合的显著黑棘皮病表现，可伴有高甘油三酯等脂代谢异常表现；（9）中心型肥胖。（10）有明确的糖尿病家族史。多项研究显示［2，29-30］自身抗体阴性是MODY 的最强预测因子，另外两个关键因素是诊断时糖化血红蛋白＜7.5%和父母有糖尿病史。

1 岁至青春期前的儿童糖尿病主要是T1DM，在青春期前后，更多考虑T2DM 和单基因糖尿病，但T1DM 仍是一个考虑因素。诊断单基因糖尿病和T2DM 时，阳性家族史是重要的参考因素。因此必须要询问每个儿童糖尿病的家庭成员的具体细节，包括糖尿病诊断时的年龄、诊断时的身体状况和治疗，以获得有价值的家族史。

笔者给1 名生后有持续高血糖新生儿，予NGS测序基发现KCNJ11 c.679G/A p.（Glu227Lys）变异，家系验证提示父母均未见此突变。先证者为孕39+4周，女孩，出生体质量2.12 Kg，生后因“足月小于胎龄儿，孕母妊娠期糖尿病儿”在新生儿科住院期间持续高血糖，血糖波动在8.8 ～17.4 mmol/L，基因确诊后给予口服格列本脲［0.05 ～01 mg/（kg·d），Tid 或Biol］治疗1 周后血糖逐渐恢复正常，在1 岁时停口服药物，现3 岁10月血糖定期监测正常。此患儿表现为暂时性新生儿糖尿病，借助分子诊断技术实现了精准治疗。

3 基因报告临床解读

儿童糖尿病第二代测序发现的、或者临床未证实的可疑致病突变均可依照美国医学遗传学和基因组学会以及美国分子病理学会遗传变异标准分类与指南进行判别［31］。具体的遗传变异分析流程（图1）可参照美国国立卫生研究院临床基因组资源基因注解工作组制定的标准操作流程（https：//clinicalgenome.org/，ClinGen），用于基因功能判断的各种数据可从临床相关变异数据库（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/，ClinVar）、人类基因突变数据库（HGMD®）中获取。对于功能数据缺乏的遗传变异，可用生物信息学预测法对其进行评估。

图1 基因测序致病性的判断流程图Fig.1 Flow chart for determining the pathogenicity of gene sequencing

基因报告中经常出现的意义未明突变（VUS）使得情况更加复杂，确定VUS 是否与患者的临床表现有关是糖尿病基因诊断中最具挑战性的方面之一［32］。目前，国内大部分医疗机构无专门的遗传咨询师为遗传病提供遗传咨询，因此，在建立临床诊断后，临床医师需承担为患者及家属提供遗传咨询。临床医师收到基因报告后，可以参照中国2020年发表的《遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识探讨》［33］中有关检测报告解读和遗传咨询部分进行临床解读。可能会出现以下几种情况：（1）检出与先证者表型相关且符合遗传规律的致病/疑似致病变异：临床医师应该查阅相关文献，结合临床表现与基因检测结果谨慎的对先证者确诊。通常遗传报告不提供临床指导，在建立了基因诊断后也需查阅相关文献，对临床管理进行适当的改变。例如：GCK 基因突变致MODY 无需降糖治疗，HNF1A 基因突变致MODY可能对磺脲类药物治疗更敏感。笔者用定制糖尿病基因包检测一位反复空腹高血糖10 岁8月女孩，发现HNF1A 基因c.599G＞A（p.R200Q）杂合突变，诊断MODY3，家系验证变异来源于母亲，母亲也存在空腹血糖异常，予饮食控制可正常，同胞弟弟也存在同一位点的突变，但未进行血糖检测。但本例先证者进行饮食控制后血糖控制理想，因此我们还应该注意到并非推荐MODY 最佳的治疗方案适合所有患者，注意个体化治疗。特别注意的是糖尿病线粒体DNA 突变分析，因MDM 常见致病m.3243A＞G 人群携带率高，有较低的临床外显率，且有明显的临床异质性，需谨慎对待。识别MDM 具有挑战性，线粒体突变相关的致病表型取决于携带突变的mtDNA 拷贝的比例，并有组织特异性。另外T1DM 和T2DM 也存在线粒体功能障碍，线粒体糖尿病的表型也可能具有与T1DM 和T2DM 共同临床表现。因此，临床上注意区分由原发性线粒体疾病导致症状性糖尿病与原发性糖尿病对线粒体的继发性影响非常重要。（2）检出与先证者表型相关但不符合遗传规律的致病/疑似致病变异：这种情况常见于染色体隐性遗传性糖尿病检测出一个致病杂合突变。若先证者临床表型高度符合该基因相关疾病临床表现，建议联系基因报告实验室做进一步评估、分析。（3）检出VUS：若VUS 与先证者表型高度相关且遗传模式符合，此类变异有可能构成糖尿病病因，建议结合先证者表型和家系验证情况进一步分析，必要时组织遗传糖尿病专家、基因报告实验室、遗传学等进行多学科讨论，必要时做功能验证。若检出与先证者表型相关但不符合遗传规律VUS，先证者临床表型高度符合该基因相关疾病临床表现，可考虑选择其它检测方法或者扩大检测范围，寻找该基因的另一个致病变异。

4 功能验证

对于新发致病突变或者有临床意义的VUS，有条件的可进行变异功能验证。首先需建立合适的糖尿病疾病模型。近年来，利用人类干细胞建立疾病模型成为研究热点。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell lines，hESCs）及患者特异性诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的整体分化模型为研究遗传疾病对人类胰腺中β 细胞发育以及人类胰腺本身的胚胎发育的影响提供了有用的工具［34］。许多研究已成功地使用CRISPR/Cas9 工具通过单个遗传变异对β 细胞分化和功能的影响［35］。因T1DM 和T2DM 患者受自身免疫、环境以及多遗传因素影响，利用人类干细胞分化模型对T1DM 和T2DM 建立疾病模型具有挑战性［36］，但是对于MODY 或PNDM 糖尿病表型糖尿病是一个理想的选择［37］。

5 总结

在精准医学时代，基因检测已被证明是鉴定糖尿病遗传原因重要工具。被诊断的遗传性糖尿病，受益于精准的临床管理、遗传咨询、新的治疗药物。不断报道的已知基因的新突变和新基因，有助于糖尿病发病机制的了解。在这样的背景下，应该重视遗传因素在儿童糖尿病的致病作用，积极查阅相关文献，做好与基因检测方、患者沟通，对基因检测的选择与基因报告的临床解释需谨慎。

【Author contribution】DONG Guoqing and HUANG Miao designed，wrote and revised the article. DONG Guoqing，HUANG Miao and LU Xiyan Reviewed the literatures. All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.