circ_0005276靶向miR-557调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭

2023-03-09崔家康高青杰马俊福孟庆良

实用医学杂志 2023年2期

崔家康高青杰马俊福孟庆良

1河南省中医院风湿病科（郑州 450002）；2河南中医药大学骨伤学院（郑州 450046）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎、关节骨与软骨破坏为主要特征的慢性、全身性自身免疫性疾病。其以滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、关节软骨和骨破坏等为主要病理变化，最终导致关节结构破坏、畸形和功能丧［1-2］。在RA 发病过程中，激活的RA 滑膜成纤维细胞（RA-FLS）表现出与肿瘤细胞相似的增殖和侵袭性，是导致关节骨和软骨破坏的重要因素［3-4］。因此，寻找抑制RA-FLS 增殖与侵袭的途径和靶点具有重要的研究意义。环状RNA（circRNA）是闭环非编码RNA 分子，其可与miRNA 结合以降低miRNA 活性［5］。circRNA 差异表达导致RA-FLS 侵袭和炎症因子的产生均发生改变，并可能在促进免疫、炎症、滑膜病变和关节破坏等方面发挥作用，参与RA 疾病的进展［6］。研究［7］发现，circ_0005276在上皮性卵巢癌（EOC）中表达上调，其水平与EOC 患者淋巴转移率和远处转移率呈正相关。circ_0005276 的高表达还参与调控前列腺癌细胞的增殖、上皮间质转化和迁移［8］。在前期的大鼠实验中，生物信息学分析显示circ_000527 在正常组与模型组大鼠滑膜组织之间的表达有显著差异，miR-557 与circ_0005276 存在结合位点，但circ_0005276 在RA-FLS 调控中的作用尚不明确。因此，本研究探讨circ_0005276 靶向miR-557 对RA-FLS 增殖、迁移和侵袭的影响，旨在为未来RA临床治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：SPF级雌性Wistar大鼠20只，7 周龄，体质量（200 ± 20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号：SCXK（鲁）20190003。实验期间喂养于河南省中医院动物实验中心，室温（22 ± 2）℃，可自由进食和饮水。

实验试剂：免疫源性牛Ⅱ型胶原（Chondrex）、完全弗氏佐剂（Chondrex）、TRIzol 试剂、Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（美国Invitrogen），Lipo2000、M-MLV 逆转录酶购自美国Invitrogen 公司；2×SYBR Green PCR Master mix、CCK-8 试剂盒购自北京索莱宝生物公司；si-circ_0005276、miR-557 模拟物、anti-miR-557、pcDNAcirc_0005276 及各自的对照购自南京金斯瑞生物公司；兔源Ki-67 多抗（WL01384a）、兔源N 钙黏蛋白（N-cadherin）多抗（WL01047）购自沈阳万类生物公司；羊抗兔IgG、兔源E-cadherin 多抗（ab15148）、兔源磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）多抗（ab9485）、兔源增殖细胞核抗原（PCNA）多抗（ab18197）购自上海艾博抗生物公司；Transwell 室购自美国Millipore 公司。

1.2 模型制备将大鼠随机分为正常组、模型组，每组10 只。在超净台无菌环境中，将牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂按1∶1 比例在冰浴下混匀。在大鼠适应环境3 d 后造模，模型组尾根部皮下注射0.15 mL 胶原乳剂，正常对照组尾根部注射0.15 mL生理盐水。在首次免疫7 d 后于对侧尾根部皮下注射0.1 mL 胶原乳剂加强免疫［9］。在首次免疫10 d后选择双后肢关节肿胀大鼠为取材对象。

1.3 RA-FLS 分离和培养在加强免疫3 d 后取材，剥离大鼠踝关节组织，取出滑膜组织，在无菌条件下立即切成片，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃下消化滑膜组织2 h，然后离心得到RA-FLS［10］。取第3 ～8 代RA-FLS 进行实验。RA-FLS 采用含1%青-链霉素、10%胎牛血清的DMEM在温度为37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱孵育。

1.4 RT-qPCR检测circ_0005276和miR-557表达通过TRIzol 法从滑膜组织中提取总RNA，用MMLV 逆转录酶将总RNA 反转录为cDNA，用SYBR Green PCR Master mix扩增cDNA以检测circ_0005276和miR-557 表达。其相对表达水平通过2-ΔΔCt公式计算。circ_0005276 引物序列5′-GCTAAATGGTATCCAGGGTGC-3′（上游），5′-CCCTCCTCCACAGTGAAAGC-3′（下游）；GAPDH 引物序列5′-GCTTTCTTTCCTTTCGCGCT-3′（上游），5′-TTTGCGGTGGAAATGTCCTT-3′（下游）；miR-557 引物序列5′-GTTTGCACGGGTGGGC-3′（上游），5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′（下游）；U6 引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′（上游），5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′（下游）。circ_0005276的序列中含有miR-557 的连续结合位点，见图1。

图1 circ_0005276 的序列中含有与miR-557 互补的核苷酸序列Fig.1 The sequence of circ_0005276 contains nucleotide sequences complementary to miR-557

1.5 实验分组转染前1 d，在24 孔板中以1 ×104个/孔接种RA-FLS。转染当天，将Lipo2000 与opti-MEM 培养基混合，室温孵育5 min，记为A 液；将质粒或寡核苷酸与opti-MEM 培养基混合，室温孵育5 min，记为B 液。将A 液与B 液混合，室温孵育5 min 后加入60%汇合度细胞中。收集转染48 h RA-FLS 以备后续实验。根据转染质粒或寡核苷酸不同RA-FLS 共分为si-NC 组、si-circ_0005276组、miR-NC 组、miR-557 组、si-circ_0005276 +antimiR-NC 组、si-circ_0005276 +anti-miR-557 组、pcDNA 组、pcDNA-circ_0005276 组。

1.6 CCK-8 法检测RA-FLS 活力在96 孔板中以3 × 103个/孔接种转染细胞，孵育48 h 更换为90 μL的DMEM 培养液和10 μL CCK-8 继续孵育2 h，用酶标仪检测450 nm 处的吸光度（OD）来确定细胞活力。

1.7 Western blot 检测Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin 蛋白水平RIPA 法裂解RA-FLS，SDS-PAGE 分离细胞蛋白，随后在湿法转膜仪中完成转膜。将膜在5%脱脂牛奶中封闭2 h，然后将膜依次与一抗、二抗在25 ℃反应2 h。滴加化学发光试剂使条带显色，Image J 软件分析其相对灰度值。

1.8 划痕愈合实验检测RA-FLS 迁移在6 孔板中以5 × 104个/孔接种转染细胞，37 ℃孵育至90%汇合度时，用100 μL 枪头垂直于6 孔板底划伤单层细胞，PBS 清洗细胞碎片，加入无血清培养基37 ℃孵育24 h。显微镜下拍照，测定培养0 h和24 h划痕宽度。划痕愈合率（%）=（1-0 h 划痕宽度/24 h划痕宽度）×100%。

1.9 Transwell 实验检测RA-FLS 侵袭采用包被基质胶Transwell 室评估RA-FLS 侵袭能力。用无血清培养基重悬转染细胞，取200 μL 接种于上腔室，将500 μL 完全培养基加入下腔室。孵育24 h后，穿膜细胞用4%多聚甲醛固定，并用结晶紫染色。显微镜下拍照，每个Transwell 室选择5 个视野计数，取均值表示侵袭数。

1.10 双荧光素酶报告实验根据Circular RNA Interactome 预测结果将circ_0005276 野生（WT）片段克隆到pLG3 载体中，将该重组载体命名为WTcirc_0005276。将circ_0005276突变（MUT）片段克隆到pLG3 载体中构建重组载体MUT-circ_0005276。将WT-circ_0005276、MUT-circ_0005276分别与miR-557 模拟物或miR-NC 共转染RA-FLS 中48 h，裂解细胞，测定相对荧光素酶活性以反映circ_0005276与miR-557 之间的关系。

1.11 统计学方法所有实验重复3 次，每次3 个复孔，实验数据以（）表示。采用SPSS 20.0 进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0005276 和miR-557 在CIA 大鼠滑膜组织中的表达CIA 大鼠滑膜组织中circ_0005276表达水平显著高于正常滑膜组织（P＜0.05），miR-557 表达水平显著低于正常滑膜组织（P＜0.05），见表1。

表1 circ_0005276 和miR-557 在CIA 大鼠滑膜组织中的表达Tab.1 Expression of circ_0005276 and miR-557 in synovium of CIA rats±s

组别正常组滑膜组织CIA 大鼠滑膜组织t 值P 值circ_0005276 1.00 ± 0.09 4.57 ± 0.46 22.849＜0.001 miR-557 1.00 ± 0.12 0.33 ± 0.04 15.890＜0.001

2.2 干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖的影响与si-NC 组比较，si-circ_0005276 组RA-FLS 中circ_0005276 表达水平、细胞OD 值以及Ki-67 和PCNA 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图2 和表2。

图2 干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of circ_0005276 interference on the expression of proliferation-related proteins in RA-FLS

表2 干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖的影响Tab.2 Effects of circ_0005276 expression interference on proliferation of RA-FLS ±s

组别si-NC 组si-circ_0005276 组t 值P 值circ_0005276 1.00± 0.00 0.23± 0.03 77.000＜0.001 OD 值（450 nm）0.88± 0.06 0.43± 0.04 18.721＜0.001 Ki-67 蛋白0.63± 0.05 0.25± 0.03 19.551＜0.001 PCNA 蛋白0.84± 0.06 0.32± 0.04 21.633＜0.001

2.3 干扰circ_0005276表达对RA-FLS迁移侵袭的影响与si-NC 组比较，si-circ_0005276 组RA-FLS划痕愈合率、N-cadherin 蛋白水平、侵袭数显著降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图3 和表3。

表3 干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 迁移侵袭的影响Tab.3 Effects of circ_0005276 expression interference on RA-FLS migration and invasion ±s

组别si-NC 组si-circ_0005276 组t 值P 值划痕愈合率（%）67.67 ± 5.82 25.06 ± 2.76 19.845＜0.001侵袭细胞数（个）110.71 ± 11.65 46.77 ± 4.56 15.333＜0.001 E-cadherin 蛋白0.15 ± 0.02 0.57 ± 0.05 23.398＜0.001 N-cadherin 蛋白0.74 ± 0.06 0.28 ± 0.03 20.572＜0.001

图3 干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 迁移侵袭相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of circ_0005276 interference on the expression of RA-FLS migration and invasion related proteins

2.4 circ_0005276 靶向调控miR-557 的表达在与WT-circ_0005276 共转染实验中，转染miR-557模拟物与转染miR-NC 相比导致RA-FLS 的相对荧光素酶活性显著下降（P＜0.05），见表4。si-circ_0005276 组细胞miR-557 表达水平显著高于si-NC组（P＜0.05）；pcDNA-circ_0005276 组细胞miR-557表达水平显著低于pcDNA 组（P＜0.05），见表5。

表4 双荧光素酶报告实验Tab.4 Double luciferase report experiment ±s

组别miR-NC 组miR-557 组t 值P 值WT-circ_0005276 0.97 ± 0.06 0.34 ± 0.03*28.174＜0.001 MUT-circ_0005276 0.98 ± 0.07 0.96 ± 0.06 0.651 0.524

表5 circ_0005276 调控miR-557 的表达Tab.5 circ_0005276 regulates the expression of Mir-557 ±s

注：与pcDNA 组比较，*P ＜0.05；与si-NC 组比较，#P ＜0.05

组别pcDNA 组pcDNA-circ_0005276 组si-NC 组si-circ_0005276 组F 值P 值miR-557 1.00 ± 0.00 0.43 ± 0.05*1.03 ± 0.06 2.92 ± 0.23#719.207＜0.001

2.5 miR-557 过表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭的影响与miR-NC 组比较，miR-557 组RA-FLS 中miR-557 表达水平、E-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），划痕愈合率、侵袭数以及Ki-67、PCNA和N-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图4和表6。

图4 miR-557 过表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of miR-557 overexpression on the expression of proteins related to proliferation，migration and invasion of RA-FLS

表6 miR-557 过表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭的影响Tab.6 Effects of miR-557 overexpression on proliferation, migration and invasion of RA-FLS ±s

组别miR-NC 组miR-557 组t 值P 值miR-557 1.00 ± 0.00 3.26 ± 0.28 24.214＜0.001 OD 值（450nm）0.89 ± 0.07 0.51 ± 0.05 13.252＜0.001划痕愈合率（%）69.65 ± 5.37 31.58 ± 4.57 16.193＜0.001侵袭细胞数（个）114.24 ± 12.48 50.87 ± 4.08 14.479＜0.001 Ki-67 蛋白0.64 ± 0.05 0.32 ± 0.03 16.464＜0.001 PCNA 蛋白0.86 ± 0.07 0.40 ± 0.04 17.117＜0.001 E-cadherin 蛋白0.13 ± 0.02 0.51 ± 0.05 21.169＜0.001 N-cadherin 蛋白0.77 ± 0.04 0.35 ± 0.03 25.200＜0.001

2.6 下调miR-557 表达逆转了干扰circ_0005276表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭的作用与si-circ_0005276+anti-miR-NC 组比较，si-circ_0005276+antimiR-557 组RA-FLS 中miR-557 表达水平、E-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.05），划痕愈合率、侵袭数以及Ki-67、PCNA 和N-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图5 和表7。

表7 下调miR-557 表达逆转了干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭的作用Tab.7 Downregulation of miR-557 expression reversed the effects of cirC_0005276 expression interference on the proliferation，migration and invasion of RA-FLS±s

组别si-circ_0005276+anti-miR-NC组si-circ_0005276+anti-miR-557组t值P值miR-557 1.00±0.00 0.44±0.04 42.000＜0.001 OD值（450 nm）0.41±0.04 0.79±0.05 17.804＜0.001划痕愈合率（%）23.49±2.15 56.34±4.99 18.138＜0.001侵袭细胞数（个）44.52±4.87 96.41±7.69 17.102＜0.001 Ki-67蛋白0.24±0.02 0.51±0.04 18.112＜0.001 PCNA蛋白0.30±0.03 0.72±0.06 18.783＜0.001 E-cadherin蛋白0.58±0.04 0.26±0.02 21.466＜0.001 N-cadherin蛋白0.27±0.03 0.62±0.06 15.652＜0.001

图5 下调miR-557 表达逆转了干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达的作用Fig.5 Down-regulation of miR-557 expression reversed the effect of circ_0005276 expression interference on the expression of proteins related to proliferation，migration and invasion of RA-FLS

3 讨论

RA 作为一种自身免疫性疾病，滑膜细胞的增殖和侵袭是导致RA 骨和软骨破坏的关键因素，最终导致患者肢体功能受限［11-12］。因此，明确RAFLS 侵袭的分子机制在RA 的治疗中具有重要意义。研究显示，circRNA 与RA 进展的多个环节相关，circ_AFF2 促进RA 中RA-FLS 的增殖和炎症反应［13］；circ_0088194 和circ_0088036 高表达诱导RAFLS 迁移和侵袭［14-15］。外周血单个核细胞中circ_0000175 和circ_0008410 的表达水平与RA 病情活动度和严重程度相关［16］。本研究显示CIA 大鼠滑膜组织中circ_0005276 显著上调，提示RA 发展可能与circ_0005276 失调有关。为分析circ_0005276在RA 中的功能，本研究转染si-circ_0005276 至RA-FLS 并分析其增殖、侵袭的作用途径。PCNA和Ki-67 是两种与增殖相关的蛋白，已被证实与RA-FLS 的增殖活性呈正相关［17-18］。本研究中干扰circ_0005276 表达后RA-FLS 活力以及PCNA、Ki-67蛋白水平降低，提示干扰circ_0005276 表达可抑制RA-FLS 增殖，这与之前研究表明干扰circ_0005276表达对前列腺癌细胞的抗增殖作用一致。上皮细胞-间充质转化（EMT）是肿瘤侵袭转移的关键步骤，RA-FLS 对关节软骨的高度侵蚀性与肿瘤细胞病理特征类似，提示RA-FLS 迁移和侵袭中也可能存在EMT［19］。EMT 的标志是N-cadherin 表达上调和E-cadherin 表达下调，有研究［20］表明下调Smad1基因可影响N-cadherin和E-cadherin表达，阻碍EMT的发生，抑制RA-FLS 迁移和侵袭。本研究中，干扰circ_0005276 表达导致RA-FLS 的迁移和侵袭能力降低，并伴随着N-cadherin 下调和E-cadherin 上调，证实干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 的迁移和侵袭抑制作用。以上研究表明，干扰circ_0005276 表达可能是RA 治疗的重要干预措施。

circRNA 可靶向miRNA 调控RA 进展，circ_09505 通过下调miR-6089 加重CIA 小鼠的炎症和关节损伤［21］；circASH2L 通过miR-129-5p/HIPK2 轴促进RA-FLS 的肿瘤样生物学行为和炎症反应［22］。本研究结果显示miR-557 与circ_0005276 存在直接相互作用，且在RA-FLS 中miR-557 表达受到circ_0005276 的负性调控。既往研究［23］发现，miR-557 在骨肉瘤中低表达，miR-557 的上调抑制了骨肉瘤细胞的增殖和EMT 过程。miR-557 通过靶向EFNB2 抑制胰腺导管癌进展［24］。此外，沉默circEIF6 对胰腺癌细胞的凋亡诱导和侵袭抑制作用也与上调miR-557 表达有关［25］。本研究检测到CIA 大鼠滑膜组织中miR-557 表达降低，miR-557过表达导致RA-FLS 活力下降，PCNA、Ki-67、Ncadherin 表达降低，迁移和侵袭能力降低，以及Ecadherin 表达升高，证实miR-557 对RA-FLS 肿瘤样侵袭行为的抑制作用。研究显示，下调miR-557表达在一定程度上逆转了干扰circ_0005276 表达对RA-FLS 增殖、迁移侵袭的抑制作用，表明circ_0005276 通过靶向miR-557 促进RA-FLS 增殖、迁移和侵袭行为。因此，靶向抑制circ_0005276/ miR-557 途径可能是RA 的潜在治疗策略。

【Author contributions】CUI Jiakang：conceptualization，methodology，writing-original draft；GAO Qingjie：investigation；ma junfu：formal analysis，validation；MENG Qingliang：supervision，writing-review editing. All authors read and approved the final manuscript as submitted.