Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌中的表达及临床意义研究

陈婷，仲丽娟，高凤婷

1.江苏省东台市人民医院病理科，江苏东台 224200；2.江苏省东台市人民医院内分泌科，江苏东台 224200；3.江苏省南京市浦口区中心医院病理科，江苏南京 211800

大肠腺癌为临床常见恶性肿瘤，随我国饮食习惯、生活方式改变，肠道黏膜刺激性增加，大肠腺癌发生率逐渐增加，主要表现为腹痛、腹胀、便血等症状，随病症进展，逐渐出现消瘦、体质量迅速下降、乏力、腹部包块等症状，威胁其生命安全，需尽早诊断治疗[1-2]。Raf-1蛋白激酶，为Raf基因编码的蛋白产物，具丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，具促进细胞增殖转化、细胞程序性死亡等作用，其水平升高可能会增加组织癌变风险[3]。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具促进血管新生重要因子，其水平升高可刺激局部血管数量增加，为局部组织增殖提供血运支持，而恶性肿瘤组织生长速度快，VEGF水平相应增加，考虑可将其应用至恶性肿瘤诊断中[4]。但目前为止，在大肠腺癌患者临床诊断中，应用Raf-1、VEGF诊断相关研究较少。为此，本次研究选取江苏省东台市人民医院2021年1—12月期间收治的60例大肠腺癌患者为研究对象，探究上述两种指标对其诊断价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院60例大肠腺癌患者为研究对象，男32例、女28例，年龄46~76岁，平均（62.10±4.27）岁；体质指数（body mass index,BMI）18~32 kg/m2，平均（25.41±3.02）kg/m2；分化程度：低分化21例、中高度分化39例；有淋巴结转移24例、无淋巴结转移36例；浸润深度：未突破浆膜层23例、突破浆膜层37例；Dukes分期：A期6例、B期19例、C期24例、D期11例。研究经过医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①均经病理组织诊断确诊；②年龄≥18岁；③无精神系统疾病，可配合完成研究；④患者对研究知情同意。

排除标准：①病理组织不满足免疫组化法检验者；②术前接受化疗或放疗治疗者；③局部手术治疗史者；④手术治疗不耐受者。

1.3 方法

仪器及设备：显微镜及成像系统（日本OLYMPUS，CX40）；自 动 切 片 机（德 国 Leical，RM2245）；鼠抗人VEGF单克隆抗体（购自福州迈新生物技术）；鼠抗人Raf-1单克隆抗体（购自LAB VISION）。

方法：样本采用10%福尔马林固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，连续切片（厚度为4 μm），苏木素-伊红染色，置于载玻片（涂有多聚赖氨酸），烤片（60℃，2 h）；二甲苯脱蜡、酒精梯度脱水；缓冲液浸泡（0.01 M枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0），加热至100℃后保温10 min后自然冷却；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)冲洗，3次/min，共冲洗2次，甩去多余液体，滴加50 μL3%内源性过氧化氢阻断剂，孵育（室温，10 min），甩去多余液体，加一抗，过夜（4℃）；PBS冲洗，5 min/次，共冲洗3次；甩去多余液体，滴加二抗，室温孵育（30 min），PBS冲洗，3 min/次，共冲洗3次；甩去多余液体，滴加20 μL链霉素抗生物素过氧化物酶溶液；去掉PBS溶液，滴加100 μLDAB显色液完成显色反应，后以蒸馏水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化后，PBS冲洗；酒精梯度干燥脱水，二甲苯透明，树胶封片后镜下观察。

1.4 观察指标

（1）比较两种指标在大肠腺癌中的阳性检出率。①Raf-1蛋白激酶阳性检出标准：显微镜下见细胞核出现棕黄色颗粒[5]；②VEGF阳性检出标准：细胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性[6]；以PBS一抗为阴性对照；400倍镜下随机选择切片内5个视野，每个视野内细胞数量200个，共计1 000个细胞；阴性标准为阳性细胞数量≤10%，阳性标准为阳性细胞数量>10%；③联合检测阳性标准：任意一种指标为阳性，即为联合检查阳性。（2）比较不同特征（肿瘤直径、不同分化程度、是否有淋巴结转移、浸润深度、Dukes分期）下Raf-1蛋白激酶、VEGF阳性检出率。

1.5 统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件处理数据，计数资料用[n(%)]表示，进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种指标在大肠腺癌中阳性检出率

Raf-1蛋白激酶联合VEGF对病灶阳性检出率为60.00%，较其单独诊断高（28.33%、41.67%），差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两种指标在大肠腺癌中阳性检出率

2.2 两种指标在不同特征大肠腺癌中阳性检出率

VEGF在有淋巴结转移、浸润深度突破浆膜层、Dukes分期为C期+D期中阳性检出率分别为62.50%、54.05%、54.29%，较无淋巴结转移、浸润深度未突破浆膜、Dukes分期为A期+B期27.78%、21.74%、24.00%高，差异有统计学意义（P<0.05）；VEGF在不同肿瘤直径、肿瘤分化程度中阳性检出率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；Raf-1蛋白激酶在不同肿瘤直径、分化程度、有无淋巴结转移、浸润深度、Dukes分期中阳性检出率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 两种指标在不同特征大肠腺癌中阳性检出率 [n(%)]

3 讨论

Raf蛋白激酶，由raf基因编码完成，其中Raf-1蛋白激酶广泛存在于终末分化组织[7-8]。在大肠癌发生过程中，Raf-1蛋白激酶表达增高，可使MAPKs通路被激活，抑制大肠癌组织中Colo-205、SW480细胞中P27KIP1、P21WAF1等抑癌基因表达，加速细胞周期，使癌基因、未能修复完成的受损基因大量聚集、合成，刺激肠黏膜细胞异常增生，最终刺激大肠腺癌产生[9-10]。

VEGF主要功能为刺激血管生成，在对肿瘤影响中，VEGF会直接作用在血管内皮细胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体，增加血管通透性，使血浆纤维素向外渗出，为血管新生提供细胞迁移途径，在为肿瘤组织提供血运同时，为肿瘤细胞转移提供网络通道[11-12]。

本次研究中，对大肠腺癌组织的Raf-1蛋白激酶、VEGF阳性检出率进行比较，结果显示，两种指标联合检查后阳性检出率较单独检查高，而肿瘤不同特征阳性检出率比较显示，Raf-1蛋白激酶在不同肿瘤特征检出率中差异无统计学意义（P>0.05），提示Raf-1蛋白激酶只参与肿瘤发生过程，但对其发展过程无明显影响；而VEGF在有无淋巴结转移、浸润深度、Dukes分期中阳性检出率差异有统计学意义（P<0.05），即肿瘤进展会出现VEGF阳性检出率增加的情况[13-14]。两种指标联合诊断后，可综合肿瘤发生、发展过程进行其阳性检出率评估，可互相弥补不足，进而可提升联合诊断阳性检出率。胡伊豆等[15]在对大肠癌患者研究中，以免疫组化法检测其VEGF阳性情况，发现72例大肠癌患者中，VEGF阳性检出率为61.11%，较本次41.67%稍高，考虑原因可能与样本选择存在差异性有关，淋巴结转移、侵袭深度达到浆膜外、肿瘤>5 cm时，VEGF阳性检出率显著提升（66.67% vs 47.62%，70.59% vs 38.10%，70.97% vs 53.66%），提示VEGF阳性检出率与肿瘤发展有关，与本次研究观点一致。但该研究未给出Raf-1蛋白激酶检出率情况，且未对多种免疫组化指标进行联合诊断研究，仅研究不同指标在肿瘤组织中阳性检出率，因此本次研究结果更具优势，可为大肠癌诊断、预后评估提供更准确参考依据。

综上所述，大肠腺癌患者VEGF阳性检出率提升，提示存在淋巴结转移、浸润深度增加、Dukes分期增加，可用于诊断及预后评估，且两种指标联合应用可提升阳性检出率。