富顺香辣酱主要原辅料中食源性致病细菌的分离鉴定

袁先铃，张洲铕，袁玉梅，汪创，王俊丁，雷鸣

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000;2.四川省远达集团富顺县美乐食品有限公司，四川 自贡 643200)

富顺香辣酱是以干辣椒和花椒为主要原辅料的一种半固态复合调味料，属于非发酵类辣椒酱，于2010年被列入国家地理标志产品。香辣酱除了具有红油鲜亮、酱体醇厚、浓郁鲜香、营养丰富的特点外，还具有促进食欲、改善消化的保健功效[1]。

辣椒属热带浆果类蔬菜，如今中国已是辣椒生产和消费的大国[2]。新鲜辣椒经过自然晾晒或人工烘烤脱水得到干辣椒，干辣椒作为我国传统的调味佳品[3]，被广泛应用于调味的食品添加剂和食品配料[4]，贺稚非等[5]研究发现鲜辣椒表面的微生物以细菌最多，而酵母菌和霉菌较少；张晓玲[6]的研究表明，在重庆市售的10种干辣椒样品中分离得到13种细菌。花椒分布在中国大部分地区，是川菜烹饪中必不可少的调味料，董丹等[7]研究发现市售花椒粉中菌落总数达到5.4×105CFU/g，而大肠菌群数则达到2.1×105MPN/100 g。八角是中国传统的药食同源性的香料[8]，因其含有反式茴香脑等多种有效抑菌成分，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等常见致病菌具有较高抑菌活性[9]。2012年湖南省质监局抽查发现永丰辣酱有限公司生产的永丰辣酱菌落指数超标23.5倍[10]。

目前关于香辣酱的研究主要集中于发酵辣椒酱的生产工艺、货架期、农药残留以及微生物分析方面[11-16]，对于非发酵辣椒酱的研究主要集中于生产工艺方面[17-19]，微生物分析方面的研究相对较少。由于原辅料本身带有大量的微生物，导致香辣酱产品质量不稳定，因此针对香辣酱主要原辅料中的食源性致病菌进行检测，确定具有相对优势的食源性致病细菌，并进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

香辣酱及其原辅料干辣椒、花椒、八角：由四川省远达集团富顺县美乐食品有限公司提供。

1.2 试剂

氧化钠(分析纯)：天津市福晨化学试剂有限公司；结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)、缓冲蛋白胨水(BPW)、营养琼脂(NA)、改良胰蛋白胨大豆肉汤、哥伦比亚CNA血琼脂、哥伦比亚血琼脂、李氏增菌肉汤、PALCAM琼脂、李斯特氏菌显色平板、四硫磺酸钠煌绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、亚硫酸铋琼脂(BS)、氯化钠碱性蛋白胨水、硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.3 主要仪器与设备

YXQ-75SII 立式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-2FD 净化工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PH100-2A41L-EP 生物显微镜 深圳市润兴光学仪器有限公司；GZX-9140MBE 电热鼓风干燥箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电子天平 慈溪市天东衡器厂；SPX-100B-Z 生化培养箱 上海培因实验仪器有限公司；3730XL测序仪、2720 Thermal Cycler PCR仪 美国ABI公司；JY04S-3C 凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司；Legend Micro 17离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 试验方法

1.4.1 常见食源性致病菌检测方法

根据GB 4789.4-2016[20]、GB 4789.10-2016[21]、GB 4789.41-2016[22]、GB 4789.30-2016[23]、GB 4789.7-2013[24]、GB 4789.11-2014[25]，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌科、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性链球菌进行处理及检测。

1.4.2 肠杆菌科疑似菌生理生化鉴定方法

对筛选出的食源性致病细菌疑似菌进行革兰氏染色、乙酰甲基甲醇(V.P.)、甲基红(M.R.)、糖发酵、吲哚、明胶液化、接触酶、尿素水解等生理生化实验，以判断菌的属[26]。

1.4.3 肠杆菌科疑似菌分子生物学鉴定方法

操作步骤：基因组DNA 提取：按DP336 试剂盒提取；PCR 扩增；凝胶电泳：1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 20 min 电泳观察；纯化回收：PCR 产物的电泳条带切割所需DNA靶带，纯化后的PCR产物直接用前体物测序。

将纯化后的菌株送到擎科生物有限公司进行16S rDNA测序；将得到的序列用BLAST软件进行对比分析[27]，在NCBI数据库中进行比较；根据比对的结果再结合生理生化实验确定鉴定的菌种。利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.5 数据处理和分析

利用Excel 2016统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 常见食源性致病细菌检测结果

富顺香辣酱及主要原辅料中食源性致病细菌检测结果见表1。

表1 富顺香辣酱及主要原辅料中食源性致病细菌检测结果Table 1 Detection results of foodborne pathogenic bacteria in Fushun spicy sauce and its main raw and auxiliary materials

续 表

由表1可知，干辣椒和花椒中均检出肠杆菌科疑似菌、沙门氏菌疑似菌、金黄色葡萄球菌疑似菌、副溶血性弧菌疑似菌和β型溶血性链球菌疑似菌，与Doren等[28]在辣椒等香料中检测出包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、坂崎克罗诺杆菌、梭状芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的结果基本吻合；八角中未检出上述致病菌，可能是因为八角中的茴香油对食品常见细菌有明显的抑制作用[29]；在成品中也未检出上述6类致病菌，说明在后续工艺过程中能够杀灭上述食源性致病细菌。花椒中金黄色葡萄球菌数量较少，可能是因为花椒提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效力远大于辣椒提取液[30]。干辣椒中的肠杆菌科疑似菌和金黄色葡萄球菌疑似菌的数量比花椒中多，与姜太玲等[31]研究得出花椒籽蛋白抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用的结果相符；Wang等[32]研究出花椒精油对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和单核增生乳杆菌)的抑菌圈大于革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的结果与本研究肠杆菌科疑似菌的数量明显大于金黄色葡萄球菌疑似菌和单增李斯特氏菌的数量相符。干辣椒和花椒中肠杆菌科疑似菌的数量多于金黄色葡萄球菌疑似菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，肠杆菌科为革兰氏阴性菌，可能是因为辣椒和花椒中的抑菌成分通过影响细胞壁的结构从而达到抑制效果[33-34]。

原辅料中各食源性致病细菌菌落形态特征见表2。

表2 富顺香辣酱主要原辅料中食源性致病细菌部分疑似菌菌落形态Table 2 Colonial morphology of some suspected foodborne pathogenic bacteria in the main raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

续 表

由表2可知，从数量和种属分类上推测肠杆菌科菌为富顺香辣酱主要原辅料中的相对优势致病菌，研究结果与贺稚非等[35]研究的辣椒中的革兰氏阴性杆菌多数是肠杆菌科菌，刘会平等研究的未经辐照处理的花椒粉的大肠菌群数处于较高水平结果相一致。因此，拟定对肠杆菌科疑似菌进行进一步的分离纯化、生理生化和分子生物学的鉴定分析。

2.2 肠杆菌科疑似菌鉴定结果

2.2.1 肠杆菌科疑似菌生理生化鉴定结果

从主要原辅料干辣椒中分离出肠杆菌科疑似菌11株，花椒中分离出肠杆菌科疑似菌8株，其生理生化鉴定结果见表3。

表3 富顺香辣酱原辅料中肠杆菌科疑似菌生理生化鉴定结果Table 3 Physiological and biochemical identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

2.2.2 分子生物学鉴定结果

图1 部分代表性肠杆菌科疑似菌16S rDNA序列PCR扩增序列电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified sequence of 16S rDNA sequence of some representative suspected Enterobacteriaceae bacteria

图1中序号与表3中菌株编号相对应。由图1可知，6条泳道在1 500 bp左右位置都出现了均一亮条，且无特异性扩增，符合测序要求。将条带清晰的PCR 扩增产物进行测序，测序结果经BLAST比对，选取相似度大于99%且比对分数最高的序列，确定种属。

利用聚类分析软件MEGA 6.0将原辅料中的肠杆菌科疑似菌的拼接序列进行聚类分析，采用邻位相连法(Neighbor-Joining)建立系统发育树，见图2。原辅料中肠杆菌科疑似菌鉴定结果见表4。

图2 香辣酱原辅料中肠杆菌科疑似菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of suspected Enterobacteriaceae in the raw and auxiliary materials of spicy sauce

表4 富顺香辣酱原辅料中肠杆菌科疑似菌分子生物学鉴定结果Table 4 Molecular biological identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

续 表

结合生理生化和分子生物学鉴定结果可知，从富顺香辣酱原辅料干辣椒和花椒中鉴定出肠杆菌科致病菌13株。其中干辣椒中有6株肠杆菌科致病菌，分别为大肠杆菌(Escherichiacoli)、克罗诺杆菌(Cronobacterzurichensis)、Enterobacterbugandensis、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、肠杆菌属(Enterobactersp.)、成团泛菌属(Pantoeaagglomerans)。花椒中有7株肠杆菌科致病菌，分别为欧文氏菌属(Erwiniasp.)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、塔斯马尼亚欧文氏菌(Erwiniatasmaniensis)、桃色欧文氏菌(Erwiniapersicina)、致癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。

3 结论

本研究通过检测香辣酱原辅料中几种常见食源性致病菌，确定相对优势食源性致病细菌，并对该相对优势食源性致病细菌进行分离纯化，对纯化后的菌落进行生理生化实验和16S rDNA鉴定分析，研究结果表明，干辣椒和花椒中肠杆菌科疑似菌的数量相对较多，从鉴定结果的数量和种属分类上可以确定，在富顺香辣酱主要原辅料中肠杆菌科菌为常见食源性致病细菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌科、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性链球菌)中相对优势的致病性细菌。干辣椒和花椒中共检测出19株肠杆菌科疑似菌，结合生理生化和16S rDNA分子测序鉴定出肠杆菌科菌13种。针对富顺香辣酱主要原辅料中食源性致病细菌的检测、分离与鉴定，能够了解富顺香辣酱原辅料和产品中致病性细菌情况，为香辣酱生产过程的安全控制提供一定的理论基础。