葡萄籽和石榴皮提取物处理对风干羊肉贮藏期间抗氧化及风味物质的影响

赛麦提·艾则孜,马依努尔·米吉提,巴吐尔·阿不力克木

(新疆农业大学 食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

风干肉由于携带方便、保质期长、制作简单、口感独特、营养丰富而深受消费者喜爱[1-2]。但因风干肉加工和贮藏周期较长,常规包装很容易造成蛋白质和脂肪过度氧化。风味是消费者选购肉制品的决定性因素之一[3],适量的蛋白氧化有助于提高肉制品的风味和成熟度,但脂肪和蛋白质过度氧化会降低肉制品营养物质含量，引起肉制品腐败并产生一些不良异味,肉制品在贮藏加工过程中易发生脂质和蛋白质氧化。脂质氧化会产生醛、酮、低级脂肪酸等肉制品特征风味物质，导致肉制品风味劣变[4]。

目前研究表明,真空包装和冷冻贮藏等方式可有效抑制脂肪和蛋白质的氧化，此外,烟熏也能有效地抑制肉制品贮藏期间脂肪和蛋白质的氧化。陈康等[5]研究烟熏对腊肉的货架期,结果显示烟熏处理后的腊肉能够有效地抑制产品微生物和脂肪氧化。但因上述方法需要特殊设备,且能耗较高,甚至产生一些致癌物质,在生产中受到了一定限制。另外,添加抗氧化剂是最有效的控制食品氧化的方法之一,常用的抗氧化剂有丁基羟基茴香醚(butylated hydroxy anisole,BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxy toluene,BHT)、亚硝酸钠等。虽然这些抗氧化剂能有效地抑制食品氧化,但长期被人体吸收后有致癌的可能[6],因此近年来从植物中提取的天然抗氧化剂由于其低副作用、功能性多、环保等优点被广泛应用于食品行业。

本研究以风干羊肉为原料,用葡萄籽和石榴皮提取物浸泡处理后的风干肉并进行贮藏试验。通过检测酸价、过氧化值、TBA 值、巯基含量、羰基含量等氧化指标及挥发性化合物变化,研究植物提取物对风干羊肉抗氧化及风味的影响。其目的是研究植物提取物对风干羊肉贮藏期间品质的影响,并为葡萄籽提取物和石榴皮提取物在肉制品中的应用提供理论指导和实践依据,旨在实现风干肉产业的提质增效。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与试剂

材料:新鲜羊肉,乌鲁木齐北园春农贸市场;葡萄籽提取物(原花青素>95%),陕西中鑫生物科技有限公司;石榴皮提取物,陕西嘉禾生物科技有限公司。

药品试剂:浓盐酸、KCl、Na2HPO4、NaH2PO4、MgCl、NaCl、叠氮化钠、三氯乙酸、二硝基苯阱、乙醇(60%～90%)、DTNB、冰乙酸、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯,均为分析纯。

1.2 仪器设备

JA2003max200分析天平 上海上天精密仪器有限公司;GL-20G-Ⅱ高速离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-S4恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;JZ-350便携式色彩色差仪 苏州艾森仪器设备有限公司;721可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;Flavour Spec气相离子迁移谱联用仪 德国G.A.S公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制作

原料处理:选用新鲜羊肉,按部位切割处理,大约为5 cm×3 cm×15 cm;以羊肉质量计，食盐2.7%、蔗糖2.5%、白胡椒5 g/kg,按比例混合后,采用干盐法在室温条件下腌制24 h。

低温风干:将腌制后的羊肉,在风干箱中进行吊挂风干。风干条件为风速3 m/s、相对湿度55%～70%、温度4 ℃、时间16 d。

1.3.2 抗氧化处理试验设计

将风干羊肉样品随机分为对照组和试验组,将试验组按照肉品质量分别用0.15%的葡萄籽和石榴皮提取物浸泡处理10 min,晾干20 min后进行风干,将风干后样品切分后真空包装,置于恒温25 ℃、恒湿70%的培养箱内贮藏15 d,并分别于第0,3,6,9,12,15天取样测定相关指标。

1.3.3 测定指标与方法

肌原纤维蛋白的提取:参考孙雷[7]的方法并稍作修改。称取5 g肉样剪碎后加入4倍体积的磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L，pH 6.5),于4 ℃下匀浆后离心(12 000×g,20 min);加入4倍体积含有0.1%(体积比)Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.03 mol/L，pH 6.5),于4 ℃下高速匀浆后离心(12 000 ×g,20 min),重复3次;再取沉淀加入4倍体积含有0.7 mol/L KI和0.02%(体积比)NaN3的磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.5),并剧烈振荡,4 000 r/min离心5 min,取沉淀,重复2次;沉淀即为肌原纤维蛋白。

巯基含量的测定:通过DTNB显色反应参考Benjakul等[8]的方法并稍作修改,取肌原纤维蛋白溶液采用含0.6 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液,将肌原纤维蛋白溶液稀释至2 mg/mL。空白组为磷酸缓冲溶液,代替肌原纤维蛋白溶液。试验组取1 mL肌原纤维蛋白溶液在60 ℃水浴锅中加热5 min,然后加入pH 6.8缓冲溶液9 mL,再加入10% DTNB 1 mol后搅拌,在40 ℃水浴锅中加热25 min,于412 nm 波长处测定吸光值。计算总巯基含量时,摩尔吸光系数取13 600 mol/(L·cm)， 每个样品测3个平行组,结果取平均值。

羰基含量的测定:参考魏超昆等[9]、Koutina等[10]的方法并适当修改,蛋白质溶液稀释至2 mg/mL,取1 mL稀释液加入1 mL DNPH溶液,空白组加入1 mL 2 mol/L盐酸,在37 ℃ 水浴锅中加热1 h 后加入1 mL 20% TCA,水浴锅中加热10 min,4 500 r/min离心15 min取沉淀,沉淀物加6 mol/L盐酸胍溶解,在37 ℃加热1 h,离心10 min,取上清液,于370 nm 波长处测吸光值。

酸价的测定:按照GB/T 5009.37—2003测定。

过氧化值的测定:按照GB/T 5009.37—2003测定。

TBA的测定:参考张涛等的方法并修改,取5 g样品用匀浆机捣碎均质,向捣碎的样品中加入25 mL 7.5%三氯乙酸充分搅拌后用双层过滤纸过滤,取5 mL上清液于比色管中再加入5 mL 0.02 mol/L TBA 溶液,85 ℃加热40 min,冷却到室温,1 600 r/min离心5 min,取上清液加入5 mL氯仿,静置分层后取上清液,分别在532 nm和 600 nm波长处测定吸光值并按下式计算TBA值:

挥发性风味物质的测定:GC-IMS分析条件：色谱柱类型FS-SE-54-CB石英毛细管柱(0.5 μm×15 m×0.53 mm);顶空孵化温度80 ℃;孵化时间 10 min;孵化转速500 r/min;进样针温度 85 ℃;进样体积1 mL,不分流模式;清洗时间0.50 min;载气为高纯氮气(≥99.999%);色谱柱温度 60 ℃。

1.4 数据统计分析

采用分析软件Microsoft Excel进行数据统计分析,Origin 2018进行绘图;Reporter插件:直接对比样品的二维图和三维图谱图差异;GalleryPlot插件:指纹图谱直观且定量比较不同样品之间的挥发性有机物差异;Dynamic PCA 插件:动态主成分分析,用于将样品聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物提取物处理对脂肪氧化的影响

2.1.1 不同植物提取物对风干羊肉酸价的影响

在贮藏期间,肉制品由于水分、光线、微生物、解脂酶和温度等因素的作用分解产生游离脂肪酸,从而使肉制品缓慢水解和酸败,提高酸价,降低肉品贮藏过程中稳定性的同时也产生令人不悦的味道。

图1 贮藏过程中风干羊肉酸价的变化(n=3)Fig.1 Change of acid value of air-dried mutton during storage (n=3)注:大写字母表示不同贮藏时间,不同小写字母表示有显著性差异,下图同。

由图1可知,风干羊肉在贮藏过程中酸价呈上升趋势,这与赵娇[11]的研究结果一致。葡萄籽和石榴皮提取物处理风干羊肉酸价明显低于对照组,说明两种提取物能有效地抑制风干羊肉的脂质氧化。贮藏期第15天风干羊肉对照组、石榴皮提取物处理组、葡萄籽提取物处理组酸价含量分别为4.43,3.98,3.52 mg/g,各组之间有显著性差异(P<0.05),其中葡萄籽提取物的酸价最低,是对照组的0.79倍。对照组酸价超过了肉制品卫生标准GB 2708-1994中酸价(小于4.0 mg/g)的规定。这表明葡萄籽和石榴皮提取物在风干肉贮藏过程中有一定的抑制脂肪氧化的作用，而葡萄籽提取物的抑制氧化效果高于石榴皮提取物。

2.1.2 不同植物提取物对风干羊肉过氧化值的影响

脂肪氧化是肉制品品质劣变的重要原因之一。过氧化物是脂质氧化初级产物,其本身不稳定,然而随着贮藏时间延长,这些过氧化物进一步分解成小分子的醛、酮、酸等次级产物[12]。

图2 贮藏过程中风干羊肉过氧化值的变化(n=3)Fig.2 Change of peroxide value of air-dried mutton during storage (n=3)

由图2可知,贮藏期间风干羊肉的过氧化值均呈上升趋势,这与廖婵等[13]的研究结果一致。贮藏第0天到第9天各组过氧化值上升速率较快,分别从1.48,1.84,2.30 g/100 g上升到4.79,5.01,6.28 g/100 g,而第9天到第15天上升速率缓慢。过氧化物进一步分解,到第15天过氧化值上升至5.14,5.34,7.04 g/100 g,对照组和处理组之间有显著性差异(P<0.05),但葡萄籽和石榴皮提取物处理组之间没有显著性差异(P>0.05)。

2.1.3 不同植物提取物对风干羊肉TBA 值的影响

TBA值是肉类产品不饱和脂肪酸氧化所产生的醛类物质的积累程度,醛类物质与硫代巴比妥酸(TBA)反应后产生有色化合物,这表明TBA 值直接反映肉制品脂肪氧化程度。

图3 贮藏过程中风干羊肉TBA的变化(n=3)Fig.3 Change of TBA value of air-dried mutton during storage (n=3)

由图3可知,随着贮藏时间的延长,TBA 值逐渐上升,其中对照组上升速度明显高于葡萄籽和石榴皮提取物处理组,这与李玉邯等[14]和Brewer[15]的研究结果基本一致。贮藏到第15天时,对照组的TBA值为2.85 mg/kg,葡萄籽和石榴皮提取物处理组分别为1.00,1.34 mg/kg,处理组分别是对照组的0.35倍和0.47倍,而各组之间有显著性差异(P<0.05)。这表明两种植物提取物对风干羊肉贮藏期间有一定抑制脂肪氧化的作用。

2.2 不同植物提取物处理对蛋白质氧化的影响

2.2.1 不同植物提取物对风干羊肉巯基含量的影响

巯基含量的损失是评判蛋白质氧化的主要指标之一。肉制品氧化过程中巯基容易氧化成二硫键。有报道显示,肌原纤维蛋白中55%是肌动球蛋白,每个肌动球蛋白分子大概有40个巯基[16]。

图4 贮藏过程中风干羊肉巯基值的变化(n=3)Fig.4 Change of sulfhydryl value of air-dried mutton during storage (n=3)

由图4可知,随着贮藏时间的延长,各组巯基含量逐渐呈减少趋势,这与Hamre等[17]在冻藏鱼肉过程中蛋白质氧化研究结果一致。贮藏期第15天，风干羊肉对照组、葡萄籽和石榴皮提取物处理组巯基含量分别为24.5，41.43,33.26 nmol/mg,其中葡萄籽提取物处理组的巯基含量是对照组的1.69倍,石榴皮提取物处理组是对照组的1.36倍。这表明植物提取物处理组与对照组差异显著(P<0.05),而葡萄籽提取物的抑制氧化效果高于石榴皮提取物。

2.2.2 不同提取物处理对风干羊肉羰基含量的影响

图5 贮藏过程中风干羊肉羰基值的变化(n=3)Fig.5 Change of carbonyl value of air-dried mutton during storage (n=3)

羰基是肌肉蛋白质氧化的重要指标之一。由图5可知,在贮藏期间各试验组羰基逐渐呈上升趋势,这可能是风干羊肉贮藏过程中蛋白质基团上的NH-以及NH2-的氨基酸侧链和肽键被氧化而形成了羰基化合物[18],从而导致产品中羰基含量增加,这与励建荣等[19]的研究结果一致。风干羊肉在贮藏过程中,从第0天～第6天抗氧化处理组与对照组羰基含量差异显著(P<0.05),而葡萄籽和石榴皮提取物处理组羰基含量值较接近且变化趋势一致,而第15天各组羰基含量值分别为4.47,3.23,3.61 meq/kg,这表示葡萄籽和石榴皮提取物处理组分别是对照组的0.72倍和0.81倍,表明葡萄籽提取物处理组抗氧化能力高于石榴皮提取物。

2.3 不同植物提取物对风干羊肉挥发性风味物质的影响

2.3.1 不同植物提取物对风干羊肉风味离子迁移色谱 GC-IMS 谱图对比分析

采用LAV(Laboratory Analytical Viewer)软件中的Reporter插件程序制作不同植物提取物对风干肉三维和二维对比图,见图6和图7。图6、图7可直接比较不同植物提取物处理的风干羊肉风味物质差异。其中Y轴表示气相色谱仪的保留时间,X轴表示用于识别的离子迁移时间,Z轴表示峰高通,RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物，颜色越深表示该挥发性风味物质的浓度越大。结合图6和图7可知,不同植物提取物对风干羊肉不同阶段检测到的挥发性化合物种类基本相似,但是信号强度有一定区别,如圆圈所示。这可能是由于风干羊肉随着贮藏时间的延长,脂肪和蛋白质逐渐氧化,脂肪氧化显著增加了醛类、醇类和酮类等挥发性风味物质的种类和浓度差异[20]。

图6 不同植物提取物处理风干羊肉挥发性风味成分的GC-IMS 谱图(三维)Fig.6 GC-IMS spectra (3D) of volatile flavor components in air-dried mutton treated with different plant extracts注:三维谱图(保留时间、迁移时间和峰强度)中RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。CK代表对照，PT代表葡萄籽提取物处理组，SL代表石榴皮提取物处理组。

2.3.2 不同植物提取物对风干羊肉挥发性有机物成分的GC-IMS指纹图谱的差异

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图8 不同植物提取物处理风干羊肉挥发性风味成分的GC-IMS指纹谱图Fig.8 GC-IMS fingerprints of volatile flavor components in air-dried mutton treated with different plant extracts注:xr代表新鲜肉，PT代表葡萄籽提取物处理组，SL代表石榴皮提取物处理组，CK代表对照组。

表1 不同植物提取物处理风干羊肉风味物质定性分析信息Table 1 Qualitative analysis information of flavor substances in air-dried mutton treated with different plant extracts

续 表

GC-IMS技术软件LAV中的插件程序Gallery Plot 指纹谱图更加明显地显示了不同植物提取物处理组风干羊肉样本的挥发性风味物质信息以及样本之间挥发性有机物的差异。图8代表一个样品中选取的全部信号峰,其中列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰,M 和D 分别代表该物质的单体和二聚体。由图8和表1可知,风干羊肉中挥发性物质总共35种,其中醛类6种、醇类5种、烃类5种、酮类5种、酯类6种、其他8种。

醛类肉品脂肪氧化产物也具有特别的嗅感,正己醛、庚醛、苯甲醛具有令人愉悦的清香味,而己醛、戊醛和2,4-癸二烯醛等具有油腻的腐败味[21]。由试验结果可知,对照组己醛、庚醛(单体)含量明显高于植物提取物处理组。这可能是由于风干羊肉在贮藏过程中脂肪不断氧化，醛类含量不断增加,而植物提取物有效地抑制了风干羊肉氧化,从而降低了醛类含量。

酮类主要是由肉制品不饱和脂肪酸氧化和氨基酸降解而生成的，对风味的贡献小于醛类化合物,但是会一定程度上影响肉制品风味[22]。葡萄籽和石榴皮提取物处理组2-庚酮、1-羟基-2-丙酮相对含量分别为1.00%、3.54%和0.69%、2.65%,相比于对照组1.91%、3.74%相对较低。

醇类化合物中饱和醇类的阈值较高,对气味贡献较小,但不饱和醇类阈值较低,对气味贡献较大[23]。在风干肉贮藏过程中正己醇主要由亚油酸氧化和降解而成,对风味贡献有限。本文研究的醇类总共5种,其中在贮藏第15天与对照组相比,1-戊醇、1-庚醇相对含量分别为1.26%、2.37%,而葡萄籽和石榴皮提取物处理组分别为0.93%、0.62%和1.20%、1.70%。因此,葡萄籽和石榴皮提取物能有效地抑制脂肪酸氧化和降解,从而降低醇类物质生成。

综上所述,葡萄籽提取物和石榴皮提取物处理能明显减少风干羊肉贮藏过程中脂肪氧化所产生的异味并保证产品质量。魏玲等[24]对不同程度氧化的鸭肉进行风味物质测定,结果发现脂肪氧化程度过高或过低都会对产品风味产生一定影响,当氧化程度保持在一个合适范围内时,既可保证产生充足的肉香味,又能防止脂肪过度氧化所导致的肉制品酸败。赵冰等[25]的研究结论也证实了这一观点,发现醛类物质含量随着肉制品脂肪氧化不断增加,醛类既是其他风味物质的前体物质,同时也可能形成异常的酸败气味,所以控制脂肪氧化程度对肉制品形成优质香味、防止氧化酸败具有重要意义。

2.3.3 不同植物提取物处理风干羊肉挥发性物质主成分特征分析

图9 不同植物提取物处理风干羊肉挥发性风味主成分的PCA分析图Fig.9 PCA analysis of principal components of volatile flavor in air-dried mutton treated with different plant extracts注:A代表新鲜肉，B代表第0 天葡萄籽提取物处理组，C代表第0 天葡萄籽提取物处理组，D 代表第0 天对照组，E代表第15 天葡萄籽提取物处理组，F代表第15 天石榴皮提取物处理组，G代表第15 天对照组。

依据图9构建的不同植物提取物处理风干羊肉挥发性风味物质动态变化的离子迁移色谱指纹图谱，采用 dynamic PCA plug-ins 插件程序进行PCA处理，观察不同植物提取物处理风干羊肉贮藏期间的风味动态变化特征，更直观地分析不同植物提取物处理风干羊肉贮藏期间的风味物质差异。

由图9可知,主成分1 和主成分2 的贡献率之和达到了69%,风干羊肉的各组平行样品分离良好,说明不同处理组的样品挥发性风味物质之间存在显著性的差异，这与图8指纹图谱所得到的结论一致。

3 结论

葡萄籽和石榴皮提取物处理组可有效抑制风干羊肉贮藏期间酸价、过氧化值、TBA 值和羰基含量的升高,并有效延缓巯基含量的下降。此外,GC-IMS分析结果表明,不同组样品中总共检测出35种挥发性物质,而两种植物提取物可有效降低风干羊肉中2-庚酮、2-戊基呋喃、庚醛、1-羟基-2-丙酮、1-戊醇、1-庚醇含量。葡萄籽提取物和石榴皮提取物处理能明显减少风干羊肉贮藏过程中脂肪和蛋白质氧化所产生的异味并保证产品质量。整体来看，葡萄籽提取物抑制风干羊肉脂肪和蛋白质氧化能力高于石榴皮提取物。