牡丹籽蛋白水解物对猪油贮藏期间质量的保护作用研究

李艳，李迎秋

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

食用油脂在贮藏过程中会发生氧化酸败，不仅风味改变，营养价值下降，而且会产生有害物质，危害人类健康[1-2]。添加抗氧化剂可以防止油脂的氧化酸败[3]。由于传统的人工抗氧化剂如BHT、BHA、TBHQ等被证明会产生毒副作用，寻找天然的抗氧化剂来预防油脂的氧化酸败逐渐成为研究的重点[4]。

很多天然产物已被证明是有效的抗氧化剂且没有严重的副作用。陈莉华等[5]报道麦冬叶总黄酮对植物油和动物油的抗氧化活性强于VC和柠檬酸。郭泽美[6]报道添加0.02%的葡萄皮渣多酚可显著抑制芝麻油过氧化值的提升，抑制效果强于BHT和TBHQ。颉宇[7]报道添加柠条籽肽显著抑制了核桃油过氧化值的提升，降低了油脂氧化速率。多肽类由于良好的抗氧化性、安全性以及丰富的营养价值已经成为食品领域的研究热点[8]。蛋白水解物是多肽的重要来源，由于动物中饱和脂肪酸含量以及畜牧业对环境的破坏性，植物源的蛋白水解物越来越受到人们的关注[9-10]。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)，毛茛科芍药属植物，是我国著名的传统花卉[11]。牡丹籽蛋白是一种重要的植物蛋白来源，具有良好的理化和功能特性[12]。Wang等[13]采用5种商业蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶)水解牡丹籽蛋白，表明碱性蛋白酶处理的牡丹籽蛋白水解物(AL-TPSPH)在体外具有最好的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力以及还原力，显示出良好的抗氧化活性。然而，目前还没有关于AL-TPSPH及其超滤组分对油脂质量保护的研究。

因此，本实验采用Schaal烘箱法,探究牡丹籽蛋白水解物AL-TPSPH及其超滤组分对贮藏期间的过氧化值、酸价、硫代巴比妥酸值、皂化值和碘值等质量指标的保护作用，以期为天然抗氧化剂和牡丹产业的发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹籽：由华瑞科技有限公司提供；碱性蛋白酶(alcalase)：购自北京索莱宝生物科技有限公司；冰乙酸；三氯甲烷；碘化钾；硫代硫酸钠；可溶性淀粉；95%乙醇；酚酞；氢氧化钾；盐酸溶液；环己烷；冰乙酸；韦氏试剂；三氯乙酸；乙二胺四乙酸二钠；硫代巴比妥酸。

1.2 实验方法

1.2.1 牡丹籽蛋白的制备

参照高蕾蕾[14]的方法，采用传统的碱溶酸沉法制备牡丹籽蛋白。取100 g脱脂的牡丹籽粉，加入1 000 mL蒸馏水并充分搅拌，用 NaOH溶液调节pH值至9.50，置于恒温磁力搅拌器(50 ℃)上提取3.5 h，冷却至室温，离心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)取上清，用 HCl溶液调节pH至3.60(等电点)，再次离心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)得到沉淀，水洗沉淀3次并调节pH至中性，冷冻干燥后即可得到牡丹籽蛋白，存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 AL-TPSPH及其超滤组分的制备

参照王颖颖等[15]的方法并稍作修改。称取5 g牡丹籽蛋白溶于 250 mL蒸馏水中，将pH调至8.0，加入1%的碱性蛋白酶，60 ℃酶解3 h，期间加入NaOH溶液来维持pH，随后，将酶解液煮沸10 min灭酶。冷却至室温后，离心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)取上清液，一部分上清液进行冷冻干燥即得AL-TPSPH，-20 ℃备用；另一部分上清液依次通过分子截留量为30，10，5 kDa的超滤膜。依次收集>30 kDa,10～30 kDa,5～10 kDa 和<5 kDa的截留液，冷冻干燥后于-20 ℃保存。

1.2.3 乳状液的制备

AL-TPSPH为水溶性，因此，需要加入乳化剂降低表面张力来制备乳状液。参照穆同娜[16]的方法并稍作修改：采用油水法进行乳状液的制备，其中水、乳化剂和猪油的比例为49.5∶1∶49.5，乳化剂采用Span 80 (HLB=4.3)。称取98 g猪油置于60 ℃水浴锅中融化，加入1 g乳化剂和98 g水，采用高速均质机以10 000 r/min的转速均质混合液3 min，制得乳状液。

1.2.4 AL-TPSPH添加浓度的筛选及过氧化值(POV)的测定

采用Schaal烘箱法，取200 g AL-TPSPH添加量为0.02%、0.1%、0.2%、0.3%以及BHT添加量为0.02%的乳状液于蜀牛瓶中。将乳状液置于60 ℃的烘箱中强化保存，每隔24 h搅拌一次，并交换它们在烘箱中的位置。定期测定过氧化值(POV)筛选出合适的AL-TPSPH添加浓度。根据筛选的浓度添加不同分子量(>30 kDa, 10～30 kDa, 5～10 kDa 和<5 kDa)的AL-TPSPH制备乳状液，置于60 ℃的烘箱中强化保存并定期测定油样的质量指标。其中，过氧化值(POV)根据GB 5009.227-2016提供的方法进行测定。

1.2.5 硫代巴比妥酸值的测定

参考GB 5009.181-2016提供的分光光度法并进行了一定修改，具体如下：称取4 g样品于 50 mL离心管中，准确加入40 mL三氯乙酸溶液(10 g/L)。置于 60 ℃水浴锅中保温30 min，用漩涡振荡器振摇5 min后，于4 ℃ 冰箱中冷藏2 h。用双层滤纸慢速过滤，取5 mL滤液、三氯乙酸溶液(空白)于25 mL具塞试管中，加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液(0.02 mol/L)，加塞，混匀，置于95 ℃水浴锅中孵育40 min。冷却至室温后，用紫外分光光度计于532 nm处测定吸光度值，根据国标方法换算出硫代巴比妥酸值。

1.2.6 碘值的测定

根据GB/T 5532-2008提供的方法进行碘值的测定。

1.2.7 酸价的测定

根据GB 5009.229-2016提供的热乙醇指示剂滴定法进行酸价的测定。

1.2.8 皂化值的测定

根据GB/T 5534-2008提供的方法进行皂化值的测定。

1.2.9 数据分析

所有实验均为3个重复，数据均以“平均值±标准差”表示。所有图形制作均使用Origin 8.0软件(Microcal, USA)。此外，通过SPSS软件(Version 23.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)进行单因素方差分析，通过 LSD(Fisher 's least significant difference)法进行显著性检验，P<0.05定义为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 AL-TPSPH浓度的筛选

图1 不同浓度AL-TPSPH对猪油贮藏期间过氧化值的影响Fig.1 Effect of different concentrations of AL-TPSPH on peroxide values of lard during storage

过氧化值能够反映油脂中脂质氢过氧化物的含量，是衡量油脂氧化程度的指标[17]。由图1可知，随着贮藏时间的延长，猪油的过氧化值呈现出上升的趋势。其中空白对照的过氧化值最高，在贮藏时间为25 d时达到0.859 6 mmol/kg，远高于氧化的临界值0.2 mmol/kg。与空白对照相比，AL-TPSPH的加入显著降低了猪油的过氧化值，且随着AL-TPSPH添加量的增加，过氧化值呈现降低的趋势。当AL-TPSPH的添加量为0.2%时，对猪油过氧化值的抑制作用与0.02%的BHT相当。因此，选择0.2%作为不同分子量AL-TPSPH的添加量。

2.2 AL-TPSPH对猪油贮藏期间过氧化值的影响

图2 AL-TPSPH对猪油贮藏期间过氧化值的影响Fig.2 Effect of AL-TPSPH on peroxide value of lard during storage

由图2可知，随着贮藏时间的延长，空白对照组的过氧化值显著提升，贮藏时间为25 d时，过氧化值达到0.859 6 mmol/kg。加入BHT和AL-TPSPH对猪油的过氧化值有明显的抑制作用，当贮藏时间为25 d时，过氧化值分别为0.024 5(BHT)，0.024 6(混合多肽)，0.082 7(>30 kDa)，0.276 3(10～30 kDa)，0.024 1(5～10 kDa)，0.066 4 (<5 kDa) mmol/kg。其中5～10 kDa的AL-TPSPH显示出最好的抑制效果，且当贮藏时间为5，10,15 d时，过氧化值一直为0，显示出最强的脂质氢过氧化物抑制能力。王颖颖[18]报道5～10 kDa的AL-TPSPH中含有最高含量的疏水性氨基酸(42.59%)，增强了清除自由基的能力，这可能是增强其抑制脂质氢过氧化物的重要原因。

2.3 AL-TPSPH对猪油贮藏期间酸价的影响

图3 AL-TPSPH对猪油贮藏期间酸价的影响Fig.3 Effect of AL-TPSPH on acid value of lard during storage

酸价表示中和1 g游离羧基所需的氢氧化钾的毫克数，是反映油脂酸败程度的重要指标[19]。由图3可知，新鲜的猪油酸价很低，仅为0.83 mg/g。随着贮藏时间的延长，猪油的酸价整体呈现上升趋势。当贮藏温度为60 ℃，贮藏时间为25 d时，空白对照中的油样酸价为2.77 mg/g，超过了食用油的酸价临界值2.5 mg/g。加入抗氧化剂抑制了猪油酸价的提升，尤其是10～30 kDa组分的AL-TPSPH，当贮藏时间为25 d时，猪油的酸价仅为1.5 mg/g，强于BHT(1.88 mg/g)。这可能是因为与其他组的AL-TPSPH相比，10～30 kDa组分的AL-TPSPH中含有最高含量的酸性氨基酸(Asp和Glu)，抑制了猪油的酸败[18]。然而添加>30 kDa 组分的AL-TPSPH时，酸价远高于空白对照组，这可能是因为此组分含有较多的大分子肽、蛋白等，在贮藏过程中水解产生了较多的羧基基团。

2.4 AL-TPSPH对猪油贮藏期间硫代巴比妥酸值的影响

图4 AL-TPSPH对猪油贮藏期间硫代巴比妥酸值的影响Fig.4 Effect of AL-TPSPH on thiobarbituric acid value of lard during storage

硫代巴比妥酸值可以反映不饱和脂肪酸的氧化产物醛类如丙二醛等的含量，也是衡量油脂氧化程度的重要指标[20]。由图4可知，随着贮藏时间的延长，所有组的硫代巴比妥酸值均呈现上升趋势。当贮藏时间为25 d时，空白对照组的硫代巴比妥酸值已显著提升至0.944 5 mg/kg，而其他组的硫代巴比妥酸值分别为0.196 7(BHT)，0.182 7(混合多肽)，0.165 2(>30 kDa)，0.474 1(10～30 kDa)，0.184 2(5～10 kDa)，0.140 5(<5 kDa) mg/kg。结果表明，加入BHT和AL-TPSPH均对贮藏期间猪油硫代巴比妥酸值的提升有明显抑制作用，且AL-TPSPH(混合物)，>30 kDa，5～10 kDa 以及<5 kDa 组分的AL-TPSPH的抑制作用与 BHT 相当。

2.5 AL-TPSPH对猪油贮藏期间皂化值的影响

油脂的皂化值可以反映其相对分子质量大小[21]。贮藏期间不同处理方式下猪油皂化值的变化情况见图5。

图5 AL-TPSPH对猪油贮藏期间皂化值的影响Fig.5 Effect of AL-TPSPH on saponification value of lard during storage

总体来看，猪油的皂化值在贮藏期间呈现先上升后下降的趋势，但不同的处理方式之间无显著性差异，表明AL-TPSPH和BHT对猪油的皂化值影响不大，所有处理组猪油的相对分子质量无明显变化。

2.6 AL-TPSPH对猪油贮藏期间碘值的影响

碘值是反映油脂不饱和程度的指标。油脂被氧化后，碘值下降[22]。贮藏期间不同处理方式下猪油碘值的变化情况见图6。

图6 AL-TPSPH对猪油贮藏期间碘值的影响Fig.6 Effect of AL-TPSPH on iodine value of lard during storage

所有处理组猪油碘值均呈现下降趋势，这说明所有组的猪油均发生了不同程度的氧化。当贮藏时间为25 d时，空白处理组猪油的碘值最低，为43.92 g/100 g。加入BHT和AL-TPSPH后一定程度上抑制了猪油碘值的下降，在贮藏时间为25 d时，碘值分别为48.78(BHT)，47.11(混合多肽)，48.8(>30 kDa)，47.97(10～30 kDa)，49.66(5～10 kDa)，46.65(<5 kDa) g/100 g。其中抑制作用最好的 5～10 kDa组分的AL-TPSPH与过氧化值一致。

3 结论

总的来说，添加0.2%的AL-TPSPH对猪油贮藏期间的过氧化值、酸价、硫代巴比妥酸值以及碘值等质量指标的改变显示出强大的保护作用。其中，5～10 kDa组分的AL-TPSPH对猪油过氧化值提升和碘值下降的抑制作用最强，优于BHT。10～30 kDa组分的AL-TPSPH对猪油酸价的提升显示出最好的抑制作用，优于BHT。除了10～30 kDa组分的AL-TPSPH外，所有组分的AL-TPSPH均对猪油硫代巴比妥酸值的提升显示出良好的抑制效果，与 BHT 相当，而BHT和AL-TPSPH对猪油的皂化值无明显作用。因此，牡丹籽蛋白水解物可以显著抑制油脂的过氧化，尤其是5～10 kDa的超滤组分，为抗氧化剂的开发以及牡丹籽粕的综合利用提供了更为广阔的思路。