陈酿温度和乙偶姻含量对镇江香醋川芎嗪含量变化的影响

刘卓非，陆震鸣，张晓娟，柴丽娟，李信，史劲松，许正宏*

(1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡 214122；3.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122；4.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江 212143)

我国传统发酵食醋具有独特的风味和良好的保健功效，是深受人们喜爱的调味品之一[1]。研究表明[2-4]，我国传统食醋含有黄酮、多酚、川芎嗪等多种生理活性物质。其中，川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)对治疗高血压和脑血栓等疾病有积极作用[5-7]，并且在食醋中体现出了较高的抗氧化性和降血脂能力，具有治疗心血管疾病的潜在功效[8-10]。同时，川芎嗪也是传统食醋的重要风味物质之一[11]。陈酿是传统发酵食醋生产过程中的必要工序之一[12-13]。在陈酿过程中，川芎嗪含量随着陈酿时间的延长而增加[14]。川芎嗪的合成主要有两种途径：一是乙偶姻、双乙酰、氨基酸等前体化合物通过美拉德反应生成[15]；二是通过芽孢杆菌等功能微生物代谢生成[16]。Xiao等[17-18]采用同位素示踪法推断，在食醋陈酿阶段，乙偶姻与铵离子是川芎嗪合成的重要前体物质。研究表明镇江香醋中的川芎嗪主要在加热煎煮后和陈酿阶段通过美拉德反应大量生成，而其前体物质——乙偶姻与铵离子在发酵过程中积累[19]。目前有研究从醋醅中分离驯化了具有产乙偶姻功能的微生物群落[20]，进行了原位强化实验，将镇江香醋中乙偶姻含量提高了1倍以上[21]。

本实验在前期研究的基础上，通过生物强化促进醋酸发酵阶段乙偶姻的积累，提高镇江香醋中初始乙偶姻含量，考察初始乙偶姻含量和陈酿温度对镇江香醋陈酿过程中川芎嗪含量积累的影响，分析两个因素的交互作用，并对不同陈酿温度与初始乙偶姻含量下陈酿1年的镇江香醋挥发性物质差异进行分析，为提升镇江香醋川芎嗪含量及控制产品品质提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

镇江香醋样品：由江苏恒顺醋业股份有限公司提供。

乙偶姻标准品、叔戊醇(色谱纯)：上海阿拉丁试剂有限公司；甲醇(色谱纯)、乙酸(色谱纯)、川芎嗪标准品、1-萘酚(分析纯)、一水肌酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

S220 pH计、BSA2202S电子天平 上海Mettler Toledo仪器有限公司；Waters e2695高效液相色谱仪(Empower色谱工作站、2489紫外可见光检测器) 美国Waters公司；KQ-50E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机 美国Eppendorf公司；SHP-250生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；BWS-5恒温水槽、水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；UV-1000紫外分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 陈酿实验条件

镇江香醋样品pH为3.50，总酸为5.5 g/dL，乙偶姻含量为240 mg/L，陈酿时间为0个月。对镇江香醋样品分别设置6个初始乙偶姻含量(240，480，960，1 440，1 920，2 400 mg/L)和5个陈酿温度(20，25，30，40，50 ℃)，每组设置3个平行样品。采用灭菌处理后的50 mL样品瓶作为储存容器，每个样品装液量为45 mL，置于不同温度的培养箱中密封避光保存，共有90个样品，分别在第0，1，2，4，5，10，12个月时取样，分析乙偶姻和川芎嗪含量变化，陈酿时间为1年。

1.3.2 总酸含量的测定

采用GB/T 5009.41-2003《食醋卫生标准的分析方法》[22]中的滴定法。

1.3.3 乙偶姻含量的测定

采用比色法测定[23]。准确称取2.5 g乙偶姻，用去离子水定容至50 mL容量瓶中，配制成50 mg/mL的乙偶姻标准溶液，并稀释至不同倍数。分别取不同浓度的标准溶液100 μL，加入2.4 mL去离子水、0.5 mL肌酸溶液(质量浓度0.5%)、0.5 mL 1-萘酚溶液(质量浓度5%)、0.5 mL氢氧化钠溶液(质量浓度10%)，混匀，于30 ℃水浴1 h后，测定溶液OD520 nm。以乙偶姻浓度为横坐标，OD520 nm为纵坐标绘制标准曲线。取稀释后的镇江香醋样品100 μL，根据标准曲线测定方法得到样品的OD520 nm，利用标准曲线计算乙偶姻含量。实验设置3个平行样品。

1.3.4 川芎嗪含量的测定

采用HPLC法测定[24]。准确称取25 mg川芎嗪，用流动相定容至50 mL容量瓶中，配制成500 μg/mL的川芎嗪标准液，并稀释至不同倍数，通过HPLC法测定得到标准曲线。取4 mL镇江香醋样品，用氢氧化钠固体颗粒调节pH值至7.2，用提取剂定容至25 mL。超声提取45 min，然后以10 000 r/min的转速离心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，利用HPLC法检测川芎嗪，并根据标准曲线计算其含量。实验设置3个平行样品。

色谱柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm×5 μm)；检测器：紫外检测器；检测波长为297 nm；流动相为1%醋酸水溶液(加0.05%三氟乙酸)∶甲醇为70∶30；流速为0.8 mL/min。提取剂为1%醋酸水溶液(加0.05%三氟乙酸)∶甲醇为20∶80。

1.3.5 醋液挥发性风味物质的检测分析

采用顶空固相微萃取与GC-MS技术进行检测。固相微萃取条件：20 mL气质瓶中加入2 mL醋液、4 mL纯净水、2.5 g氯化钠和10 μL叔戊醇(8.05 g/L)，萃取头(C-WR-95/PDMS/10，Agilent,CH，Switzerland)于50 ℃恒温预热老化10 min后，将萃取头插入气质瓶吸附40 min，插入进样口，解吸5 min。

色谱条件：采用DB-WAX柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm，Agilent,CA，USA)，进样口温度为250 ℃，载气为氦气，流速为1 mL/min，进样为无分离模式。采用不分流进样方式，进行阶段升温，初始温度40 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升温至120 ℃，保持3 min，然后以10 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：信号采集使用全扫描方式进行，离子源温度设置为230 ℃，四级杆温度设置为150 ℃。电子能量为70 eV，检测电压为350 V，扫描范围为35～350 amu。

挥发性化合物分析：数据通过MassHunter Workstation Quantitative Analysis (v10.0.707.0)软件处理，将检测到的挥发性化合物质谱图与NIST谱库匹配，选取匹配度大于80%的化合物。采用内标法定量，以叔戊醇(8.05 g/L)为内标物，各挥发性化合物的含量等于内标浓度乘以化合物与内标峰面积之比。

1.3.6 数据统计与分析

采用Microsoft Excel软件对数据进行处理，采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行绘图和数据处理，采用MATLAB和SPSS软件进行相关性分析。检测结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 温度对镇江香醋中川芎嗪含量的影响

由图1中A可知，在陈酿1年时间内，镇江香醋中川芎嗪含量逐渐升高。在不改变镇江香醋初始乙偶姻含量(240 mg/L)的条件下，相同陈酿时间的镇江香醋中川芎嗪含量随着陈酿温度的上升而提高。将样品置于50 ℃下陈酿1年时，川芎嗪含量从初始的(0.94±0.00) mg/L升至(33.48±1.47) mg/L，为不同温度样品组中的最大值。

由图1中B可知，不同陈酿温度下镇江香醋中川芎嗪的生成速率均呈现先上升后平缓的趋势，且生成速率随着陈酿温度的升高而上升。当样品在50 ℃下陈酿5个月时，川芎嗪的生成速率达最高值，达到3.04 mg/(L·月)；在20 ℃下陈酿1个月时，川芎嗪的生成速率达最低值0.03 mg/(L·月)。在前期0～4个月的陈酿过程中，在30，40，50 ℃下陈酿的镇江香醋中川芎嗪的生成速率呈现快速上升趋势；在此后5～12个月的陈酿过程中，该3组的川芎嗪生成速率均维持在较高的水平。而20 ℃和25 ℃下陈酿的样品中川芎嗪的生成速率虽在第0～4个月略有提高，但整体维持在一个较低的增长水平。结果表明，陈酿温度是影响川芎嗪物质生成的关键因素之一。川芎嗪在食醋陈酿阶段通过美拉德反应生成，而美拉德反应作为一种吸热反应，温度升高可以有效提高反应速率[25]，所以提高陈酿温度有助于川芎嗪的积累及生成速率的提升。

采用Logistic回归方程对不同陈酿温度下的镇江香醋中川芎嗪含量变化进行曲线拟合，方程及参数见表1。

表1 不同陈酿温度下镇江香醋陈酿过程中川芎嗪含量变化的拟合方程及参数Table 1 Fitting equations and parameters of ligustrazine content changes during the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures

续 表

由表1可知，所有拟合方程的方差(R2)均在0.990以上，说明Logistic回归方程对川芎嗪含量变化的拟合效果良好。计算各拟合方程中斜率最大值所对应的时间，获得不同陈酿温度下川芎嗪生成速率达到最大时所需的时间。结果表明，陈酿温度越高，川芎嗪生成速率达到最大值所需的时间越短，在20～50 ℃的陈酿温度范围内，最多可缩短30.30%的时间。由美拉德反应生成的风味物质在反应前期呈现出线性变化，而后随着加热时间的延长，物质积累逐渐达到平衡状态[26]，所以在镇江香醋的陈酿过程前期，川芎嗪的生成速率达到最大值需要一定的时间，而根据拟合方程的计算结果可知，升高陈酿温度可以缩短川芎嗪积累所需要的时间，从而快速提高食醋中的川芎嗪含量。

2.2 初始乙偶姻含量对镇江香醋中川芎嗪含量的影响

图2 初始乙偶姻含量对镇江香醋陈酿过程中川芎嗪含量(A)及生成速率(B)的影响(陈酿温度：50 ℃)Fig.2 Effect of initial acetoin content on the content (A) and formation rate (B) of ligustrazine in the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar (aging temperature: 50 ℃)

由图2中A可知，在1年的陈酿时间内，不同初始乙偶姻含量的镇江香醋样品组中的川芎嗪含量均逐渐增大。在陈酿温度为50 ℃的条件下，同一时间内的镇江香醋中川芎嗪含量随着初始乙偶姻含量的增大而增大。初始乙偶姻含量为2 400 mg/L的样品组陈酿1年时，川芎嗪含量为所有样品组中的最大值，可达(60.39±5.16) mg/L。由图2中B可知，在同一时间内，川芎嗪的生成速率随着初始乙偶姻含量的增加而提升。不同初始乙偶姻含量样品组中的川芎嗪生成速率均呈现先上升后平缓下降的趋势。在0～5个月的陈酿时间内，不同初始乙偶姻含量样品中的川芎嗪生成速率呈现上升趋势，且最高生成速率出现在陈酿5个月时，最高生成速率可达6.21 mg/(L·月)；而在第5～12个月中，川芎嗪的生成速率开始放缓，其中初始乙偶姻含量为960，1 440，1 920，2 400 mg/L的样品组中川芎嗪的生成速率在10～12个月中略有降低。由结果可以看出，乙偶姻在该反应中作为川芎嗪的前体物质，提高反应物的含量有助于反应的正向进行，提高川芎嗪的含量及生成速率。而随着反应的不断进行，乙偶姻被逐渐消耗，因此，川芎嗪的生成速率在后期有缓慢降低的趋势。

对不同初始乙偶姻含量下的镇江香醋中川芎嗪含量变化进行Logistic回归方程拟合，方程参数及结果见表2。

表2 不同初始乙偶姻含量下镇江香醋陈酿过程中川芎嗪含量变化的拟合方程及参数Table 2 Fitting equations and parameters of ligustrazine content changes during the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar with different initial acetoin content

由表2可知，各拟合方程的R2均在0.990以上且均方根误差(RMSE)最高仅为1.50，说明拟合效果良好。计算得到在不同初始乙偶姻含量的条件下镇江香醋中川芎嗪生成速率达到最大值所需时间。结果表明，随着初始乙偶姻含量的升高，川芎嗪生成速率达到最大值所需的时间随之缩短，在初始乙偶姻含量为240～2 400 mg/L的范围内，最高可缩短时间9.82%。说明初始乙偶姻含量的增加有助于缩短川芎嗪积累所需要的时间，但与受陈酿温度影响缩短的时间(30.30%)相比较小，一方面可能是由于在反应初期，乙偶姻作为前体物质含量较为充足，在陈酿温度不变的情况下，只提高乙偶姻含量对前期川芎嗪的生成速率影响有限；另一方面可能是因为在美拉德反应过程中，乙偶姻除转化成川芎嗪外，还可能会生成如吡咯、噻唑等其他产物。

2.3 陈酿温度与乙偶姻含量的交互作用分析

不同初始乙偶姻含量的镇江香醋在不同陈酿温度下陈酿1年时，所有样品组中的川芎嗪含量差异见图3。

图3 陈酿1年时不同陈酿温度和乙偶姻含量下镇江香醋中川芎嗪含量对比Fig.3 Comparison of ligustrazine content in Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures and acetoin content during one-year aging

由图3可知，初始乙偶姻含量为2 400 mg/L的镇江香醋样品在50 ℃下陈酿1年的川芎嗪含量最高，达到(60.39±5.16) mg/L；在20 ℃下陈酿，初始乙偶姻含量为240 mg/L的镇江香醋样品中川芎嗪含量最低，为(10.28±0.60) mg/L。而在不同陈酿温度下的镇江香醋样品组中，初始乙偶姻含量为2 400 mg/L样品中的川芎嗪含量均为各组中最高值。

以初始乙偶姻含量为240 mg/L样品组中的川芎嗪含量为对照组，分别计算与其他不同初始乙偶姻含量样品组中川芎嗪含量的差值，结果见图4中A。同时，以陈酿温度为20 ℃的样品组中的川芎嗪含量为对照组，分别计算与其他温度下样品组中川芎嗪含量的差值，结果见图4中B。

图4 陈酿温度对不同初始乙偶姻含量的镇江香醋中川芎嗪含量的影响(A)及初始乙偶姻含量对不同陈酿温度下镇江香醋中川芎嗪含量的影响(B)(陈酿1年时)Fig.4 Effect of aging temperature on the content of ligustrazine in Zhenjiang aromatic vinegar with different initial acetoin content (A) and effect of initial acetoin content on the content of ligustrazine in Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures (B) (aging for one year)

由图4中A可知，陈酿温度的升高会增大240 mg/L初始乙偶姻含量样品组中川芎嗪含量与其余样品组间的差值，说明陈酿温度的上升会提高初始乙偶姻含量对样品中川芎嗪含量的影响。由图4中B可知，随着初始乙偶姻含量的增大，不同陈酿温度下样品组间川芎嗪含量的差值也随之增大，说明两个因素对川芎嗪含量的影响是相互的。

对陈酿1年的所有样品进行陈酿温度与初始乙偶姻含量两个因素间的交互作用分析,结果见表3。

表3 陈酿温度和初始乙偶姻含量的交互作用对川芎嗪生成影响的分析结果Table 3 Analysis results of the effect of the interaction between aging temperature and initial acetoin content on the formation of ligustrazine

由表3可知，两个因素间的交互作用对川芎嗪的生成具有高度显著的影响(P<0.001)，说明在镇江香醋的陈酿过程中，在川芎嗪前体物质乙偶姻含量充足的情况下，提升食醋的陈酿温度，可以有效提升川芎嗪的含量，起到协同增效的作用。因此，通过生物强化技术提高醋酸发酵过程中乙偶姻的积累，从而增大镇江香醋的初始乙偶姻含量，再适当提高陈酿温度可以加速川芎嗪的生成与积累，进而提升食醋品质。

2.4 不同陈酿温度与初始乙偶姻含量下镇江香醋中挥发性化合物的差异

不同陈酿温度和乙偶姻含量对陈酿1年的镇江香醋挥发性化合物含量的影响见图5。

图5 不同陈酿温度和乙偶姻含量对陈酿1年的镇江香醋挥发性化合物含量的影响Fig.5 Effect of different aging temperatures and acetoin content on the content of volatile compounds in one-year-aged Zhenjiang aromatic vinegar

在陈酿1年的90个镇江香醋样品中，共检测到80种挥发性化合物，陈酿后的镇江香醋挥发性化合物整体组成上较为一致，包括醇类、醛类、酸类、酯类、酚类、酮类、吡嗪类等化合物，其中主要为酯类物质(22种)和醇类物质(12种)。由图5可知，酸类和醇类物质含量受温度及初始乙偶姻含量的影响较小。在50 ℃下陈酿的样品中，酯类物质含量较低，可能是由于酯类物质在高温下易发生水解[27]；而醛类物质含量较高，可能是由于发生了美拉德反应[28]。在初始乙偶姻含量不变的情况下，酮类物质含量随着陈酿温度的升高而降低，其中含量最高的酮类物质为3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)；而初始乙偶姻含量的增加有助于增强食醋的奶油香气。吡嗪类化合物共检测到9种，其中含量较高的吡嗪类物质包括2,3,5-三甲基吡嗪(川芎嗪)、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪等，吡嗪类物质通常具有坚果香和烘焙香，是镇江香醋的重要香气组成之一[29]。吡嗪类物质主要通过美拉德反应生成，所以50 ℃下陈酿的样品组中吡嗪类物质含量高于其余各组，且随着初始乙偶姻含量的增加而提高，证明高温条件下陈酿可以促进食醋中美拉德反应的进行，乙偶姻含量的增加有助于吡嗪类化合物的积累，对镇江香醋的品质提升具有积极作用。

3 结论

在1年的陈酿过程中，温度和初始乙偶姻含量的提高均对镇江香醋中川芎嗪的积累具有促进作用。陈酿温度(20～50 ℃)的升高和初始乙偶姻含量(240～2 400 mg/L)的增大可以提高川芎嗪的含量及生成速率，还可缩短川芎嗪达到最大生成速率所需时间。当镇江香醋陈酿1年时，川芎嗪含量与陈酿温度和初始乙偶姻含量间具有高度显著的相关性(P<0.001)，且两个因素间的交互作用对镇江香醋中川芎嗪的生成具有高度显著的影响(P<0.001)。陈酿温度和初始乙偶姻含量的提升有助于镇江香醋中吡嗪类物质的积累，提升食醋的风味。本研究结果可为食醋品质的提升及质量控制等提供研究基础。