具核梭杆菌诱导自噬调控蛋白LC3高表达在食管鳞癌中的临床意义

何珂瑶 刘怡文 张哲源 张家豪 代宁涛 杨海军 孔金玉 周福有，4

1新乡医学院第三附属医院胸外科（河南新乡 453003）；2河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院，河南科技大学肿瘤研究所，河南省肿瘤表观遗传重点实验室（河南洛阳 471003）；3安阳市肿瘤医院病理科（河南安阳 455000）；4安阳市肿瘤医院胸外科，河南省食管癌精准防治医学重点实验室（河南安阳 455000）

食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）发病率与病死率极高，病因至今尚未完全明确［1-2］。笔者既往研究证实，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）为ESCC的关键致病因素［3-4］。资料显示，病原微生物入侵可引发宿主细胞自噬反应，并通过多种生物学机制发生自噬逃逸，从而长期定植并促进多种肿瘤的发生发展及化疗耐受［5-7］。微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）是最早发现的自噬调节因子，多种病原微生物可通过调控LC3活性，引起自噬小体堆积，为自身定植提供条件［8-10］。因此推测Fn可能通过激活LC3，诱发自噬反应，促进ESCC恶性演进。

本研究首先建立LC3敲降的ESCC细胞系，分别用Fn感染亲本与敲降细胞系，探索LC3在Fn促癌机制中发挥的作用。并检测ESCC组织中Fn感染及LC3表达情况，进一步分析二者对ESCC患者生存期的影响，为ESCC防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 ESCC细胞系KYSE150及Fn菌株（本实验室冻存）；四氧化锇、丙酮、环氧树脂（德国Merck生命科学公司）；醋酸铀、柠檬酸铅（中国ChemicalBook公司）；LC3抗体（英国Abcam公司）；GAPDH抗体、山羊抗兔IgG、ECL发光显影液（中国CWBIO公司）；免疫组化试剂盒（中国ZSGB-BIO公司）；RNAscope试剂盒及Fn特异性探针（美国ACD公司）；凝胶成像仪（美国Thermo公司）；透射电镜（日本Hitachi公司）；酶标仪（美国PerkinElmer公司）。

1.2 Fn感染ESCC细胞 厌氧工作站中常规培养Fn。培养箱中常规培养KYSE150。将Fn（菌液OD600nm=1～2）加入KYSE150培养基（MOI=10），感染12 h及24 h，进行后续实验。具体细菌及细胞培养方法参照本课题组前期研究［11］。

1.3 Western blot 各组细胞蛋白（30 μg总蛋白/泳道）经电泳、转膜、封闭后，LC3（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗体孵育4 h，山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2 h。ECL发光显影液于凝胶成像仪中检测蛋白条带，Image Lab软件测定灰度值。以LC3-Ⅱ与GAPDH比值为最终LC3-Ⅱ相对表达量［12］。实验重复3次。

1.4 透射电镜 各组细胞经戊二醛及四氧化锇固定、梯度丙酮脱水、渗透液渗透、环氧树脂包埋后，常规切片（片厚100 nm）。经醋酸铀及柠檬酸铅染色后，用透射电镜观察各组细胞中自噬小体。

1.5 慢病毒载体包装 培养箱中常规培养293T细胞，采用慢病毒包装试剂盒，将LC3敲降质粒（LC3-DNA）配制为LC3-DNA-EndoFectin混合物，加入293T培养基中，48 h后收取病毒上清，加入KYSE150培养基中。嘌呤霉素筛选后，Western blot检测敲降效率。将LC3敲降后的细胞命名为KYSE150-LC3。

1.6 平板克隆 各组细胞均于6孔板中铺入每孔2 mL细胞悬液（含1×103个细胞），常规培养1周。经甲醛固定、结晶紫染色后，拍照并计数克隆数［13］。实验重复3次。

1.7 划痕实验 各组细胞均于6孔板中常规培养。待细胞融合至70%，用无菌枪头划痕。至培养箱常规培养，每隔6 h对同一位置细胞拍照。用Image J软件测量并计算各组细胞的迁移面积［14］。实验重复3次。

1.8 Transwell Matrigel胶包被Transwell小室基底膜。各组细胞饥饿培养24 h后，取100 μL细胞悬液（含1×105个细胞），加入Transwell小室，并向下室加入600 μL含血清培养基，常规培养24 h。擦去小室上层细胞，经甲醛固定、结晶紫染色后，拍照并计数穿过基底膜的细胞数［15］。实验重复3次。

1.9 病例资料 选取2015年1月至2017年1月安阳市肿瘤医院216例ESCC患者癌组织及相应癌旁组织石蜡包埋标本为研究对象，于术前获得患者知情同意，且经伦理委员会审核批准（批件号：2022WZ17K01）。纳入标准及排除标准见图1，最终纳入211例ESCC患者。

图1 本研究ESCC患者的入组标准及临床病理特征Fig.1 Enrollment criteria and clinicopathological characteristics of ESCC patients in this study

1.10 RNAscope ESCC组织及相应癌旁组织病理切片（片厚2 μm），经脱蜡、水化、靶标修复液修复、双氧水及蛋白酶孵育、Fn探针杂交后，显色试剂显色。结果判定：细胞浆可见红色颗粒为Fn 16S rRNA表达阳性。本研究中：（1）Fn感染阳性细胞判定标准为细胞中红色颗粒≥8个；（2）Fn感染阳性样本判定标准为每张切片中阳性细胞比例≥30%。具体操作步骤及评分细则参照本课题组前期研究［16］。

1.11 免疫组化 同批ESCC组织及相应癌旁组织连续切片（片厚2 μm），经脱蜡、水化、抗原修复后，试剂盒中试剂1及试剂2封闭。LC3抗体（1∶200）、试剂3及试剂4孵育后DAB显色。复染、脱水、透明后封片。结果判定：细胞浆出现棕黄色颗粒为LC3表达阳性。本研究中LC3阳性判定标准为评分＞4分。具体操作步骤、阳性对照、阴性对照及评分细则参照文献［17］。

1.12 统计学方法 （1）采用SPSS 26.0软件及GraphPad 5.0软件进行统计学分析及绘图。（2）计量资料以（±s）表示，t检验比较两组间差异；单因素方差分析比较两组以上组间差异。（3）计数资料采用χ2检验分析相关性，Cohen's kappa系数分析一致性（Kappa＞0.7，一致性显著）。（4）生存分析：①Kaplan-Meier生存分析比较各组间生存时间差异；②生存时间为患者入院时间至最后1次随访日期或死亡；③随访时间为60个月；④删失数据为随访至60个月仍存活的患者（59例），未删失数据为由ESCC导致的死亡患者（152例）。（5）P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fn感染对KYSE150中LC3及自噬小体的影响 采用Fn感染KYSE15012h及24h。通过Western blot检测各组细胞中LC3-Ⅱ表达情况（图2A、B）结果显示：与KYSE150相比，KYSE150+Fn（12 h）及KYSE150+Fn（24 h）中 LC3-Ⅱ表达量逐渐增高（P＜0.05）。采用透射电镜观察KYSE150及KYSE 150+Fn（24 h）中自噬小体形成情况（图2C、D）结果显示：与KYSE150相比，KYSE150+Fn（24 h）中自噬小体数量增加（P＜0.05）。

图2 Fn感染可诱导KYSE150中LC3-Ⅱ高表达及自噬小体富集Fig.2 Fn infection induced high expression of LC3-Ⅱand enrichment of autophagosomes in KYSE150

2.2 Fn感染及LC3高表达对KYSE150增殖能力的影响 采用Western blot检测LC3敲降效率（图3A、B）结果显示：与KYSE150相比，KYSE150-LC3中LC3表达量降低（P＜0.05），成功建立LC3敲降的稳定细胞系。用Fn感染KYSE150及KYSE150-LC3，实验分为 KYSE150组、KYSE150-LC3组、KYSE150+Fn组及KYSE150-LC3+Fn组。采用平板克隆检测各组细胞的增殖能力（图3C、D）结果显示：与KYSE150组相比，KYSE150-LC3组增殖能力降低（P＜0.05）；而KYSE150+Fn组增殖能力增强（P＜0.05）。与KYSE150+Fn组相比，KYSE150-LC3+Fn组增殖能力降低（P＜0.05）。

图3 Fn感染及LC3高表达对KYSE150增殖能力的影响Fig.3 Effect of Fn infection and LC3 high expression on the proliferation of KYSE150

2.3 Fn感染及LC3高表达对KYSE150迁移及侵袭能力的影响 采用划痕实验（图4A-C）及Transwell（图4D、E）检测各组细胞的迁移及侵袭能力，结果显示：与KYSE150组相比，KYSE150-LC3组上述能力降低（P＜0.05）；而KYSE150+Fn组上述能力增强（P＜0.05）。与KYSE150+Fn组相比，KYSE150-LC3+Fn组上述能力降低（P＜0.05）。

图4 Fn感染及LC3高表达对KYSE150迁移及侵袭能力的影响Fig.4 Effect of Fn infection and LC3 high expression on the migration and invasion of KYSE150

2.4 ESCC组织中Fn感染及LC3表达检测 采用RNAscope检测Fn感染情况，结果显示：癌细胞及间质细胞胞浆出现红色颗粒，为Fn感染阳性（图5A），而相应癌旁组织中Fn多为阴性（P＜0.05，图5E及表1）。采用免疫组化检测LC3表达情况，结果显示：癌细胞胞浆出现棕黄色颗粒，为LC3表达阳性（图5B），而相应癌旁组织中LC3多为阴性（P＜0.05，图5F与表1）。癌组织中Fn感染率及LC3阳性率分别为39.81%及41.71%，二者具有显著一致性（P＜0.05，表2）。

图5 Fn感染与LC3表达检测结果（DAB染色，×400）Fig.5 Detection results of Fn infection and LC3 expression（DAB staining，× 400）

表1 ESCC组织及相应癌旁组织中Fn及LC3阳性率的比较Tab.1 Comparison of positive rates of Fn and LC3 in ESCC tissues and corresponding adjacent tissues 例（%）

表2 ESCC组织中Fn感染与LC3高表达的一致性分析Tab.2 Consistency analysis of Fn infection and LC3 high expression in ESCC tissues 例（%）

2.5 Fn感染及LC3高表达与ESCC患者临床病理特征的相关性 将2张连续切片中Fn及LC3同时判定为阳性的样本定义为Fn诱导LC3高表达阳性组，以Fn+LC3（+）表示（75例）；不满足2张连续切片同时阳性的归为阴性组，以Fn+LC3（-）表示（136例）。分析各因素与患者临床病理特征的相关性（表3）结果显示：Fn感染、LC3高表达及Fn+LC3（+）的ESCC患者中，男性多于女性，有吸烟、饮酒史的患者多于无吸烟、饮酒史的患者，低分化患者多于中-高分化患者，肿瘤浸润深度侵及外膜的患者多于未侵及外膜的患者，有淋巴结转移的患者多于无淋巴结转移的患者，临床分期为Ⅲ/Ⅳ期的患者多于Ⅰ/Ⅱ期的患者（均P＜0.05）。

表3 Fn感染及LC3表达与ESCC患者临床病理特征的相关性Tab.3 Correlation analysis of Fn infection and LC3 expression with clinicopathological features of ESCC patients 例（%）

2.6 Fn感染及LC3高表达对ESCC患者生存期的影响 分析各因素与ESCC患者生存期之间相关性。结果显示：211例ESCC患者术后5年总生存率为27.96%（图6A），其中Fn感染阳性、LC3表达阳性及Fn+LC3（+）组患者的5年总生存率及中位生存时间均显著低于阴性组患者（P＜0.05，图6B-D）。且与Fn感染及LC3表达阳性的患者相比，Fn+LC3（+）患者5年生存期缩短更显著。

图6 ESCC患者术后生存曲线Fig.6 Survival curve of ESCC patients after surgery

3 讨论

ESCC是常见的恶性肿瘤。笔者发现，Fn感染阳性的ESCC患者预后不良［4］。阐明Fn致病的分子机制对降低ESCC发病率及改善患者预后至关重要。

病原微生物对宿主微环境的重塑机制至今尚未完全明确，但多数可引发宿主细胞自噬反应，并演进出多种机制发生自噬逃逸［18-20］。LC3为自噬标志蛋白。当自噬被诱导时，胞浆中的LC3-Ⅰ被修饰成膜结合型LC3-Ⅱ，转定位于自噬小体双层膜表面，一般以LC3-Ⅱ表达量评估自噬水平［21-22］。多种病原微生物均可通过调控LC3表达及转定位，诱发癌细胞自噬。幽门螺旋杆菌、乙肝病毒及人乳头瘤病毒均可通过激活LC3，诱发癌细胞自噬，协助自身大量复制，并促进胃癌、肝癌及宫颈癌的恶性增殖［8-10］。本研究发现，Fn感染后，ESCC细胞中LC3表达量及自噬小体数量增加，表明Fn感染可诱导LC3高表达，引发ESCC细胞自噬反应。为探明LC3在Fn促癌机制中发挥的作用，建立LC3敲降的ESCC细胞系，分别用Fn感染亲本与敲降细胞系，发现Fn感染时，ESCC细胞的LC3蛋白增加、恶性生物学行为增强，提示Fn可通过诱导LC3高表达，引发自噬潮，促进ESCC细胞快速增殖及恶性侵袭。LC3敲降时，上述指标均降低，提示LC3的激活与ESCC细胞恶性生物学行为的维持密切相关。而Fn感染LC3敲降的ESCC细胞时，并不能引起上述指标增强，提示LC3的敲降阻断了Fn在ESCC细胞中的促癌作用，表明LC3是Fn感染引起ESCC恶性演进过程中的关键调控因子。

研究显示，LC3已成为多种肿瘤的关键治疗靶点［23-25］。本研究发现，ESCC组织中Fn感染率及LC3阳性率分别为39.81%及41.71%，二者具有一致性，提示Fn感染的ESCC细胞中LC3高度激活。Fn感染及LC3高表达患者多为有吸烟、饮酒史的男性患者，提示由于大多数男性患者长期吸烟、饮酒，Fn定植率高，定植部位LC3多为高表达。且随肿瘤分化程度降低，二者阳性率逐渐增高，提示Fn感染及LC3高表达与肿瘤的恶性程度有关。二者阳性组的患者肿瘤浸润程度深、淋巴结转移率高、临床分期多为Ⅲ/Ⅳ期，提示Fn感染及LC3高表达可促进ESCC的恶性演进。二者阳性组的患者5年生存期均缩短，且二者共阳性组的患者5年生存期缩短更显著，提示Fn感染及LC3高表达均可影响ESCC患者生存期，且二者共阳性对患者生存期影响最大。

综上所述，Fn可通过诱导LC3高表达，引发自噬反应，促进ESCC恶性演进。由于病原微生物感染与肿瘤的发生发展是一个多因素的复杂过程，Fn的具体致病机制仍有待进一步探讨，但有效清除Fn并抑制其对ESCC细胞自噬的诱导作用，对延长患者生存期至关重要。