周期蛋白依赖激酶抑制因子3通过调控G2/M期检查点促进肝内胆管癌细胞生长并降低对顺铂的敏感性

朱志文 阳亮芳 郑杨 黄海丽 何惠娟

广东医科大学附属医院肝胆外科（广东湛江 524001）

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一种高致命性的上皮细胞恶性肿瘤，在肝脏原发性恶性肿瘤中约占10%～15%，发病率仅次于肝细胞肝癌。近年来ICC发病率不断攀升，根治性手术切除是ICC的唯一潜在治疗方法［1］。ICC极易向胆管壁浸润并侵犯周围肝组织，对于局部晚期或转移性病灶的不可切除的患者，顺铂（DDP）联合吉西他滨是当前治疗晚期ICC的一线疗法［2-3］。但化疗耐药性在ICC治疗中已越来越普遍，已成为ICC治疗失败的主要原因［2-3］，因此寻找ICC治疗的分子靶点对降低耐药率和提升治疗效果至关重要。

周期蛋白依赖激酶抑制因子3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）位于染色质14q22.22，所编码的蛋白质含有212个氨基酸残基［4］。作为一种细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制剂，CDKN3能与CDK1/CDK2特异性结合并使其去磷酸化。其次，CDKN3可与MDM2和P53形成蛋白复合物，从而对P21产生抑制作用［5］。研究表明，CDKN3参与许多生物学过程，包括细胞周期转化、DNA复制和DNA损伤修复等。目前，已在多种类型的癌症中观察到CDKN3表达增加，高水平的CDKN3与肺腺癌、食管鳞癌、胃癌和肝癌的预后不良密切相关［6-9］。最近的报告还显示，CDKN3在促进肿瘤化疗耐药中也具有潜在作用，高水平的CDKN3可导致食管鳞癌和结肠癌细胞对DDP治疗不敏感［10-11］。然而，CDKN3在ICC进展和化疗敏感性中的作用尚未明确。

当前研究发现CDKN3在ICC组织中呈高表达，CDKN3参与ICC的发生发展和化疗敏感性，其生物学功能与细胞周期的异常调控密切相关，表明CDKN3可作为ICC的一个有希望的治疗靶点。总之，本研究结果以期为ICC的诊断、治疗以及发病机制提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本收集 收集2018年10月至2021年12月在本院接受胆管癌根治手术患者的胆管癌组织及相应的癌旁组织25例，所有病例均有完整且详细的病历资料，本研究得到广东医科大学附属医院伦理委员会的批准（受理号：PJ2017066）［1］，并获得每位患者及其家属的知情同意。

1.1.2 细胞 人肝内胆管癌细胞HCCC-9810均购自中国科学院细胞库。

1.1.3 试剂 DMEM培养基、血清FBS购自Gibco；培养皿购自耐斯生命科技公司；Transwell小室购自立沃生物科技公司；PVDF膜购自Millipore；免疫组化试剂购自中杉金桥；裂解液RIPA购自碧云天；干扰和过表达质粒购自上海吉凯基因公司；顺铂购自MCE；细胞周期检测试剂盒（C1052）购自碧云天。

1.1.4 抗体 CDKN3（PA550929）购自Invitrogen；CDC25C（4688S）购自CST；p-CDK1（Thr14）（2543S）购自CST；β-actin（8457S）购自CST。

1.1.5 仪器 Tanon5200曝光机、Leica显微镜、BD FACSCantoⅡ流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 IHC免疫组化实验 经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。实验前65℃烤片30 min，脱蜡、水化。柠檬酸盐修复液经微波炉高火抗原修复8 min，两次。自然冷却后，用内源性过氧化物阻断剂避光孵育30 min，甩干滴加一抗（CDKN3抗体浓度为1∶100），4℃过夜。次日洗去一抗，滴加二抗孵育50 min，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加DAB显影剂，纯水终止显影。苏木素染液孵育2 min后流水返蓝5 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。自然晾干后拍照。

1.2.2 细胞培养、转染和DDP处理 HCCC-9810人肝内胆管癌细胞培养于含有10%Gibco胎牛血清和1%抗青霉素、链霉素的DMEM培养基中，放置于5% CO2浓度、37℃的恒温培养箱内，待细胞处于生长对数期进行实验。转染前一天，HCCC-9810细胞以每孔2×105个接种于6孔板内，次日待细胞生长至孔板面积70%左右，按照转染试剂说明书转染阴性对照质粒、CDKN3敲低质粒以及CDKN3过表达质粒，Western blot验证转染效率。DDP处理时间为24 h，处理浓度为20 μmol/L。

1.2.3 生物信息学分析 分析来自GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE26566数据集，该数据集包含104例胆管癌组织和59例与之匹配的非癌性肝脏组织的转录组信息。将GSE26566胆管癌样本按CDKN3的中位表达量分为低表达组和高表达组，通过DAVID在线数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行 KEGG 富集分析和GO功能注释。

1.2.4 细胞周期实验 细胞周期实验根据制造商的要求，按照说明书的步骤完成后使用BD FACSCantoⅡ流式细胞仪进行流式细胞术分析。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖能力 对于克隆形成试验，将转染24 h的HCCC-9810细胞用胰酶消化，PBS清洗后接种在6孔板中，每孔500个细胞，每组均设置3个复孔，置于37℃、5% CO2浓度的恒温培养箱中培养14 d后，用PBS轻轻清洗平板，多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色1 h，随后流水冲洗，自然晾干后拍照。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力 将转染24 h并处于对数生长期的细胞培养在6孔板中，各组细胞消化后接种于6孔板内，待24 h细胞铺满后用200 μL枪头竖直划痕，用PBS冲洗划下的细胞，换液后拍照。在培养48 h时继续拍照，用Image J软件计算划痕愈合率。

1.2.7 Westernblot免疫印迹实验（WB） 收集细胞，用配制好的RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后配平，煮沸使蛋白变性，按照40 μg上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜。第2天洗膜后加入二抗室温孵育1 h，洗膜后显影，用Tanon5200系统成像，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法 所有实验数据均由Graphpad 8.0软件进行统计学分析和做图，数据以（±s）表示。两组间均值比较采用配对t检验以分析统计差异，Spearman相关性系数分析两组数据的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDKN3在胆管癌组织中呈高表达 首先分析了GSE26566数据集中正常组织和胆管癌组织的CDKN3的表达情况，并将收集的胆管癌组织和癌旁组织进行免疫组化染色，数据集和免疫组化结果共同显示，与周围正常组织相比，胆管癌组织中的CDKN3表达显著增加（P＜0.05，图1A-B）。

图1 CDKN3在ICC组织中被上调Fig.1 CDKN3 was upregulated in intrahepatic cholangiocarcinoma tissues

2.2 GO功能注释和KEGG富集分析预测CDKN3在胆管癌中参与的途径和生物学过程 将GSE26566的胆管癌样本分为CDKN3低表达组和高表达组，进行基因代谢和功能的富集分析，结果见图2A-B。共挖掘出1 431个正相关基因和1 643个负相关基因，KEGG富集分析显示这些基因参与细胞周期信号通路的调控，GO功能注释显示这些基因主要参与细胞G2/M期转换和有丝分裂等过程。

图2 CDKN3参与调控细胞周期G2/M期转化Fig.2 CDKN3 was involved in regulating drug metabolism and G2/M phase checkpoint

2.3 干扰CDKN3可通过诱导G2/M期阻滞抑制ICC细胞增殖和迁移 根据KEGG和GO富集分析提示，CDKN3共表达基因参与细胞周期G2/M期转换。为验证这一预测，首先通过质粒转染的方式抑制细胞中CDKN3的表达，WB检测质粒感染效率（图3A），通过克隆和划痕和实验发现，沉默CDKN3后抑制了细胞增殖和迁移能力（P＜0.05，图3B-C和表1［2］）。细胞周期实验发现，与对照组相比，si-CDKN3组的HCCC-9810细胞在G2/M期比例明显增高（P ＜ 0.05，图3D和表1［3］），相应的G0/G1期细胞比例减少，而S期无明显变化。为进一步探究其中的分子机制，首先通过STRING数据库预测了CDKN3的蛋白互作网络，发现CDKN3可与G2/M期检查点蛋白CDC25C直接相互作用（图3E）。并且分析了GSE26566数据集中CDC25C的表达情况，发现胆管癌组织中CDC25C的表达均明显高于正常组织（P＜0.05，图3F），随后进一步分析了CDKN3和CDC25C在胆管癌组织中的相关性，结果显示两者之间呈正相关（P＜0.05，图3F）。在干扰CDKN3后，通过WB检测G2/M期检查点蛋白的表达情况，结果显示CDC25C表达被显著降低，而CDK1低活性的磷酸化水平增加（P＜0.05，图3G、表1）。以上结果均表明CDKN3通过影响胆管癌细胞G2/M期转换，从而参与到胆管癌的发生发展中。

表1 转染si-CDKN3对HCCC-9810细胞增殖、迁移、细胞周期和周期相关蛋白表达的影响的影响Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

表1 转染si-CDKN3对HCCC-9810细胞增殖、迁移、细胞周期和周期相关蛋白表达的影响的影响Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

注：si-NC组与si-CDKN3组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

分组si-NC si-CDKN3细胞周期（%）G0/G1 47.73±1.07 38.41±1.41**S 44.98±0.38 46.35±1.19 G2/M 7.28±1.39 15.24±0.34**细胞克隆数目（个）175.0±12.49 122.7±6.03**细胞迁移率（%）64.16±4.09 47.37±3.94**周期蛋白相对表达CDKN3 1.05±0.12 0.39±0.09**CDC25C 1.06±0.14 0.72±0.16*p-CDK1 0.69±0.13 1.02±0.08*

图3 干扰CDKN3可通过诱导G2/M期阻滞抑制ICC细胞增殖和迁移Fig.3 CDKN3 inhibition suppressd proliferation and migration of ICC cells by inducing G2/M arrest

2.4 CDKN3过表达降低胆管癌细胞对DDP治疗的敏感性 细胞周期的异常调控在肿瘤细胞增殖和化疗耐药中发挥重要作用，推测CDKN3可能和胆管癌化疗敏感性有密切联系。通过克隆形成和划痕等一系列细胞功能实验，结果显示，DDP处理组的胆管癌细胞其增值和迁移能力与对照组相比显著降低，但过表达CDKN3后，胆管癌细胞的增殖和迁移能力得到了有效的挽救（P＜0.05，图4A、4B和表2），证实了CDKN3能够降低胆管癌细胞对DDP治疗的敏感性。

图4 CDKN3过表达可降低胆管癌细胞对DDP的敏感性Fig.4 Overexpression CDKN3 reduced the sensitivity of cholangiocarcinoma cells to cisplatin

表2 CDKN3对DDP治疗的影响Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

表2 CDKN3对DDP治疗的影响Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

注：NC组与NC+DDP组比较，NC+DDP组与CDKN3+DDP组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

分组NC NC+DDP CDKN3+DDP细胞克隆数目（个）183.7±17.50 75.0±9.54**119.9±15.10*细胞迁移率（%）67.11±4.39 31.43±5.20**50.46±6.16**

3 讨论

ICC是仅次于肝细胞肝癌的第二常见原发性肝恶性肿瘤。随着外科手术的进步，治疗性切除已成为ICC最常见的治疗方法，但由于2/3的肿瘤在诊断时已是局部晚期或转移性病灶，因此很多不适合切除［12］。标准姑息性化疗（吉西他滨和DDP）有利于ICC患者的总生存率，但中位生存期仍低于一年［3］。目前，导致ICC化疗耐药的分子机制尚未明确，因此，深入了解ICC增殖、迁移和化疗耐药的分子机制是当前的迫切需要。

CDKN3是一种周期蛋白依赖激酶抑制蛋白，正常情况下CDKN3负责CDK1/CDK2去磷酸化。尽管CDKN3对CDK1/CDK2具有负调节作用，传统上被认为是细胞周期进程的负调节因子，但最近的研究发现，CDKN3的异常高表达与多种癌症的发展进程有关，包括宫颈癌、食管鳞癌和前列腺癌等，高水平的CDKN3可导致不良的临床预后［7，13-14］。而在不同类型的癌症中CDKN3发挥的作用也不尽相同，究其原因可能是CDKN3下游作用的靶点不同导致。此外，CDKN3还可作为一些MicroRNA的下游靶点。在非小细胞肺癌中，miR-181d-5p通过靶向CDKN3抑制AKT通路激活，从而发挥抑癌作用［15］。MiR-127-3p则通过下调CDKN3/E2F1轴的活性，抑制肾细胞癌的增殖和转移［16］。然而，CDKN3在ICC中的作用目前未曾有过报道，因此探究CDKN3与ICC发展进程的关系，将有助于更深一步了解ICC发病的分子机制，进而为ICC的临床治疗提供新思路。

在当前研究中，通过GEO数据库和免疫组化结果，发现CDKN3在ICC组织中的表达较癌旁组织显著升高。为进一步研究CDKN3在ICC中的生物学功能，首先进行了KEGG和GO富集分析，两者结果一致表明与细胞周期相关的生物过程和途径是共表达基因富集程度最高的原因，CDKN3可能参与ICC细胞周期G2/M期转化。为验证上述预测，用转染质粒的方式干扰ICC细胞中CDKN3的表达，通过克隆和划痕一系列功能实验发现，抑制CDKN3的表达可有效减弱ICC细胞增殖和迁移能力，同时，细胞周期实验表明，沉默CDKN3可显著诱导G2/M期阻滞，这与富集分析预测的结果相一致。为进一步探究CDKN3调控G2/M期转化的分子途径，通过CDKN3的蛋白互作网络发现，CDKN3可与CDC25C直接相互作用，以及相关性分析显示CDKN3和CDC25C在胆管癌组织中的表达呈强正相关，我们推测CDKN3可能通过靶向CDC25C而发挥作用。后续的WB检测发现，干扰CDKN3后CDC25C表达水平显著降低，导致CDK1去磷酸化激活减少而低活性的磷酸化水平增加。CDC25C是细胞周期G2/M期的重要检查点蛋白，CDC25C作用于CDK1 Thr14和Tyr15残基并使其去磷酸化，CDC25C介导的CDK1去磷酸化和CyclinB1/CDK1复合物入核是调节细胞分裂起始的关键机制［17-18］。当 CDC25C活性受到抑制时，CyclinB1/CDK1复合物的活性也会受到抑制，因此CDC25C在控制细胞周期方面起着至关重要的作用［17-18］。最近的一些研究显示，通过下调CDC25C/CDK1/CyclinB1信号轴，可有效诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞，抑制癌症进展［19-20］。因此，本研究结果得到了之前结论的有力支持。

越来越多的研究已表明，细胞周期的异常调控是肿瘤细胞化疗耐药的重要机制之一。有趣的是，ICC细胞在转染CDKN3过表达质粒后，通过DDP治疗发现，CDKN3过表达挽回了DDP对ICC细胞增殖和迁移能力的抑制作用，CDKN3显著降低了ICC细胞对DDP治疗的敏感性。之前已有研究发现，CDKN3能够促进食管癌和结直肠癌细胞对DDP产生耐药，抑制CDKN3后可恢复肿瘤细胞对DDP的敏感性［10-11］。最新的报告还指出，CDKN3通过调控LDHA依赖的代谢重编程，促进膀胱癌细胞对DDP抵抗，而抑制CDKN3的表达对克服膀胱癌化疗耐药具有潜在作用［21］。以上发现与本研究结果一致。

综上所述，本研究探索了CDKN3在ICC发展进程中的生物学功能和作用机制，研究表明：CDKN3在ICC组织中高表达，与ICC发生发展密切相关；CDKN3沉默可通过下调CDC25C/CDK1轴引起G2/M期阻滞，从而抑制ICC细胞增殖和迁移能力；CDKN3过表达可有效降低DDP治疗的敏感性，这可能是ICC细胞化疗耐药的潜在机制。总之，这些结果提示CDKN3是治疗ICC的一个很有希望的靶点。