炎性小体与缺血性脑卒中发病及中医相关机制的研究进展

苏 钰，朱文浩

全球疾病负担研究(GBD)显示，我国总体脑卒中终生发病风险为39.9%，位居全球首位，也是我国疾病所致寿命损失的首位病因[1]。缺血性脑卒中导致脑组织缺血，神经元细胞无法维持正常的跨膜离子梯度和平衡，从而导致细胞凋亡、兴奋性毒性、氧化应激和炎症等一系列细胞死亡的发生[2]。炎症反应研究是当前脑卒中研究的热点之一。

“炎性小体”一词由Tschopp Jürg博士等在2002年首次提出[3]，并将炎性小体描述为一个“Caspase激活复合物”，由半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-5、Pycard(Caspase相互作用域)和NALP1(NLRP1的旧名称)组成，该复合物负责促炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)的成熟[4]。在先天免疫系统参与免疫应答时，当检测到微生物成分或内源性损伤信号后，由模式识别受体(PRR)识别病原体相关分子模式和危险相关分子模式(PAMPs和DAMPs)，触发启动下游信号级联反应，调节各种免疫应答，并导致形成一个称为炎性小体的多蛋白复合体[5]。炎性小体主要是由不同的受体蛋白(如NLRP1、NLRP3、NLRP4和AIM2等)、衔接蛋白[凋亡相关斑点样蛋白(ASC)]和效应蛋白半胱氨酸蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)组成的多蛋白复合体[6]。炎性小体的传感器通过ASC的胱天蛋白酶募集结构域(CARD)招募pro-Caspase-1形成炎性小体，随后促炎性因子白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)和白细胞介素-18前体(pro-IL-18)可被Caspase-1裂解为促炎症分子的活性形式，启动下游信号通路，引发炎症反应[7-8]。研究显示,炎性小体在缺血性脑卒中后的炎症反应中有关键作用。本研究对NLRP3炎性小体、NLRP1炎性小体、NLRP4炎性小体和AIM2炎性小体的结构组成、激活模式及在缺血性脑卒中发病机制中的作用进行论述。

1 NLRP3炎性小体

1.1 NLRP3炎性小体的结构与组成 NLRP3炎性小体由NLRP3受体、ASC、pro-Caspase-1 三部分组成。NLRP3受体包括3个结构域：包含C-端的亮氨酸重复序列(LRR)、中心的核苷酸寡聚化(NACHT)结构域、N-端的热蛋白(PYD)结构域和胱天蛋白酶募集(CARD)结构域[9]。

1.2 NLRP3炎性小体的激活 在健康的细胞条件下，由于NACHT结构域和LRRs之间的内部相互作用，NLRP3被自动抑制[10]。在检测到细胞应激后，NLRP3的NACHT结构域之间通过同型交互作用寡聚，其PYD与含有ASC的PYD结构域相互作用，之后ASC又通过CARD/CARD交互招募pro-Caspase-1[10]。最后，pro-Caspase-1自我切割并形成活性Caspase-1，并介导成熟的、具有生物活性的细胞因子参与免疫防御[5]。

NLRP3炎性小体的组装和下游信号的激活依赖于两种与细胞损伤相关的互补信号：一种启动信号，需要通过核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路上调NLRP3炎性小体复合物蛋白、pro-IL-1β及pro-IL-18[11]；第二种信号导致NLRP3激活和ASC磷酸化，从而触发其组装到NLRP3炎性小体复合物中[12]。NLRP3对一系列不同的物质刺激产生反应，这些物质包括晶体和颗粒物质(如尿酸晶体、二氧化硅、石棉和明矾)、细胞外ATP、成孔毒素、RNA-DNA杂交体以及几种病毒、细菌、真菌和原生动物病原体[13]。NLRP3受体可以感受到动态平衡的紊乱，并通过以下几个过程做出反应自大多数是相互协同不排斥的：①胞浆中低K+浓度可触发NLRP3活化；②胞内Ca2+积累可诱导有害信号通路，激活NLRP3炎性小体；③溶酶体不稳定可刺激组织蛋白酶释放，诱导NLRP3活化；④线粒体损伤诱导的活性氧(ROS)生成可激活NLRP3，损伤线粒体DNA[14]。此外研究发现，蛋白激酶7(PK7)对于NLRP3的激活是必不可少的，并且作用于钾外流的下游[13]。

1.3 NLRP3炎性小体在缺血性脑卒中的作用 缺血性脑卒中有关炎性小体的研究众多，其中对NLRP3炎性小体的研究最为广泛深入。目前，主流观点认为NLRP3炎性小体诱导急性缺血性脑卒中的神经炎症[15]，在脑卒中神经元细胞死亡和行为缺陷中发挥主要作用[16]。NLRP3可产生众多促炎细胞因子，介导神经细胞功能障碍和脑水肿，一旦激活最终导致神经细胞死亡[14]。通过研究短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)小鼠模型发现，NLRP3缺失可保护小鼠免受缺血性脑损伤，减少梗死体积和水肿形成，保持血脑屏障(BBB)的通透性，减少炎症反应[17]。因此，NLRP3炎性小体被认为是治疗脑缺血再灌注时脑水肿的重要靶点。实验显示，NLRP3炎性小体特异性抑制剂MCC950具有抑制NLRP3炎性小体扩大梗死区水通道蛋白4(AQP4)的表达和分布的作用[18]。

随着NLRP3炎性小体在临床中的应用逐步深入，有关NLRP3炎性小体在缺血性脑卒中疾病中的激活通路和参与组成有了进一步的研究。在缺血条件下初级皮质神经元和脑组织，NF-κB和MAPK信号通路在NLRP1和NLRP3炎性小体的表达和激活中发挥了关键作用[19]。脑卒中后炎症诱导受体互相作用蛋白3(RIP3)/混合谱系激酶区域样蛋白(MLKL)信号通路的激活，而MLKL触发NLRP3炎性小体，另外缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)也参与了RIP3/MLKL通路，HIF-1α的表达在缺血性脑卒中后增加[20]。研究表明，布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是NLRP3炎性小体的重要组成部分，是NLRP3炎性小体活化所必需的，并可能是缺血性脑卒中的有效治疗靶点[21]。重组骨桥蛋白(OPN)能够缩小大鼠缺血性梗死面积，减轻脑缺血损伤，这可能与其参与炎性小体和小胶质细胞炎症激活的抑制调节有关[22]。NLRP3炎性小体除了可作为治疗靶点，对于急性缺血性脑卒中病人的预后同样具有一定的临床应用价值。NLRP3炎性小体是脑梗死病人早期神经功能恢复不佳的危险因素[23]。NLRP3炎性小体参与了急性缺血性脑卒中的炎症级联放大[24]，NLRP3炎性小体表达越高，则病人早期神经功能恢复情况愈差。此外，NLRP3炎性小体组分基因的基因型组合CARD8 rs2043211/NLRP3 rs 10754558AT/CG，是动脉粥样硬化血栓型缺血性脑卒中的危险因素[25]。NLRP3炎性小体蛋白编码基因中的核苷酸变异可能对缺血性脑卒中有重要影响，携带杂合子的CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558的男性患缺血性脑卒中的风险更高[26]。

也有研究对于NLRP3炎性小体在缺血性脑卒中的主导地位提出质疑。Schölwer等[27]认为，NLRP3在缺血刺激后的炎症反应中起次要作用，在缺血后的吞噬作用调节中有关键作用。ASC以NLRP3依赖的方式在持续性炎症的扩散中发挥关键作用，这可能是脑卒中复发的原因之一[28]。但Denes等[29]研究认为，NLRC4和AIM2炎性小体参与了急性缺血性脑损伤，这与ASC有关，但NLRP3不参与。Lemarchand等[30]用抑制剂MCC950靶向NLRP3或使用敲除NLRP3的小鼠发现其对脑卒中引起的损伤程度没有影响，表明NLRP3通路并没有促进炎症加剧缺血性脑损伤。

2 NLRP1炎性小体

2.1 NLRP1炎性小体的结构与组成 NLRP1炎性小体由4部分胞质成分组成[31]：NLRP1受体、ASC(有Caspase募集域的凋亡相关斑点样蛋白)、pro-Caspase-1、半胱氨酸蛋白酶-4前体和半胱氨酸蛋白酶-5前体(pro-Caspase-4和pro-Caspase-5)。NLRP1受体包含5个特征性的结构域：N-末端PYD、中央的NACHT、LRRs、FIIND(未发现功能的区域)和C-末端的CARD[3]。

2.2 NLRP1炎性小体的激活机制 NLRP1炎性小体的激活形成机制主要有2种模式[31]：NLRP1受体的C-末端的CARD域在缺少调控蛋白ASD的情况下可以直接与pro-Caspase-1相互反应；NLRP1受体的N-末端PYD域趋近与下游同型的调控蛋白ASD的PYD域进行蛋白质-蛋白质相互作用，经由ASD的CARD域连接于pro-Caspase-1的CARD域。

2.3 NLRP1炎性小体在缺血性脑卒中的作用 在缺血条件下的初级皮质神经元和脑组织中，NF-κB和MAPK信号通路为NLRP1和NLRP3炎性小体的表达和激活发挥了关键作用[18]。效应分子Caspase-1是NLRP1的下游靶点，异丙酚通过抑制NLRP1-Caspase-1-Caspase-6的炎症通路，在脑卒中中发挥神经保护作用[32]。研究结果显示，MCAO大鼠的NLRP1炎性小体水平升高，包括NLRP1受体、ASC和pro-Caspase-1，诱导切割的Caspase-1、成熟的IL-1β和IL-18水平升高[33]。

3 AIM2炎性小体

3.1 AIM2炎性小体的结构与组成 AIM2炎性小体是近年来新发现的一种模式识别受体，属于与免疫反应相关的HIN-200(具有200氨基酸重复序列的造血干扰素诱导核蛋白)蛋白家族的一员，因其最先是在黑色素瘤细胞株中发现并分离出来，且由于其在黑色素瘤细胞中的表达缺失造成了细胞增殖，因此将其命名为黑色素瘤缺乏因子2炎性小体[34]。AIM2受体是PYHIN(包含PYRIN和HIN结构域)家族成员，具有一个N端PYD和一个C端HIN结构域，后者由一对紧密排列的寡核苷酸或寡糖组成[17]。

3.2 AIM2炎性小体的激活 研究表明，细菌激活AIM2炎性小体需要溶解胞浆中的塔拉弗朗西斯菌亚种或单核细胞增生李斯特菌等[35-36]。AIM2炎性小体是一种模式识别受体，在受到特异性信号刺激后，产生炎性小体复合物，进而活化Caspase-1，活化的Caspase-1可裂解前体IL-1β和IL-18，从而导致IL-1β和IL-18的成熟和释放，诱导细胞焦亡的发生[37]。AIM2炎性小体也可能直接参与神经元细胞的死亡，培养的胚胎大鼠皮层神经元在受到AIM2激活剂poly(dA：dT)的刺激时，发生了依赖于AIM2炎性小体的细胞死亡[29]。

Adamczak等[38]提出了一种AIM2炎性小体激活并焦亡神经元的机制：AIM2炎性小体在细胞核内聚集，经宿主或病原DNA激活后，AIM2寡聚并激活ASC，激活细胞核内Caspase-1；ASC从炎性小体中解离并转移到细胞质中，在细胞质中低聚成焦磷酸体，并激活Caspase-1，活性Caspase-1裂解炎性细胞因子，打开泛连接蛋白-1(Pannexin-1)孔隙，诱导细胞焦亡。

3.3 AIM2炎性小体在缺血性脑卒中的作用 研究表明，AIM2炎性小体与脑卒中后的脑损伤有相关性[38]，AIM2可能是缺血性脑卒中潜在的治疗靶点。急性脑梗死病人血浆AIM2表达水平越高，其神经功能缺损越严重，脑梗死面积越大，预后更差[37]。通过建立MCAO大鼠模型和体外缺氧葡萄糖剥夺再灌注(OGD/R)处理的神经细胞模型，表明AIM2炎性小体通过母系表达基因3(MEG3)/miR-485/AIM2轴激活脑缺血-再灌注损伤期间的Caspase-1信号参与细胞焦亡[39]。Roth等[40]研究发现，脑卒中诱导表达Fas蛋白的天然配体(FasL)的单核细胞群，导致外部T细胞凋亡，在感测无细胞DNA之后，由AIM2依赖性IL-1β分泌驱动。脑内皮细胞可通过信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路依赖的方式抑制细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达和中性粒细胞黏附，至少部分通过调节STAT3的激活来抑制AIM2炎性小体，保护缺血性脑卒中后BBB的完整性，从而逆转缺血诱导的BBB损伤[41]。

4 NLRP4炎性小体

NLRC4炎性小体介导缺血性卒中后的小胶质细胞凋亡和焦亡[42]。通过使用啮齿动物脑卒中模型，发现NLRC4炎性小体和AIM2炎性小体造成脑损伤[29]。虽然对于NLRP4炎性小体与缺血性脑卒中的激活机制研究较少，但研究证明NLRP4炎性小体是心脏炎症的重要负性调节因子[43]，通过TANK结合激酶1(TBK1)/干扰素调节因子3(IRF3)和IκB活激酶复合物(IKK)/NF-κB信号通路负调控，其对于缺血性脑卒中的激活机制需进行进一步探索。

5 中药通过干预炎性小体治疗缺血性脑卒中的相关机制

中医对于治疗缺血性卒中有着一定优势，关于中药治疗缺血性脑卒中与炎性小体之间的相关机制已有初步探索。Arcctigenin(ARC)是牛蒡子中提取的一种苯基丙酸二苄基丁内酯木脂素，通过激活大脑中的沉默信息调节因子1(SIRT1)信号，抑制缺血性脑卒中诱导的NLRP3炎性小体激活及IL-1β、IL-18分泌，减轻缺血性脑卒中诱发的神经炎症，提供神经保护作用[44]。绿根皂苷元是从麦冬中提取的一种重要的甾体皂苷元，能抑制NLRP3的表达，降低OGD/r诱导的ROS的生成，抑制了MAPK通路，减轻脑缺血诱导的血脑屏障功能障碍[45]。川芎嗪是提取于中药饮片川芎的无色针状结晶，川芎嗪具有改善脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠神经功能缺损症状，控制梗死灶扩大，抑制炎性因子分泌的作用[46]。大黄酚是从大黄属植物中提取，全身给药可有效抑制脑缺血/再灌注期间的神经损伤和组织损伤，且呈剂量依赖性，能抑制NLRP3炎性小体的激活，对缺血性脑卒中具有保护作用[47]。红花黄素是一种从红花中提取的黄酮类化合物，实验显示其能使含有NLRP3炎性小体信号通路的皮层NF-κB/NLR家族pyrin域失活性，并降低血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6浓度，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤及炎症反应[48]。人参首乌提取物通过抑制大鼠缺血性脑卒中后Toll样受体4(TLR4)/NF-κB/NLRP3信号通路，增强神经和血管再生[49]。基于网络药理学筛选丹参-红花药对配伍抗缺血性脑卒中的成分靶点、作用靶点，并实验证明该配伍能够通过NF-κB信号通路下调NLRP3炎性小体的释放，阻断炎症损伤环节，最终达到抗炎性损伤的作用[50]。片仔癀对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经元凋亡具有显著的抑制作用，通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬起始复合物(ULK1)信号通路增强自噬，减轻NLRP3炎性小体相关神经炎症[51]。同样，清开灵(QKL)通过抑制AMPK介导的NLRP3炎性小体的激活，缓解脑缺血再灌注损伤，抑制炎症反应[52]。人参、当归合用通过抑制NLRP3炎性小体和小胶质细胞焦亡，对短暂性MCAO大鼠缺血性损伤起到神经保护作用[53]。研究发现，在OGD条件下清脑滴丸可抑制MCAO大鼠和人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)中NLRP3炎性小体的表达，可降低由NLRP3炎性小体介导并在MCAO大鼠中升高的炎性细胞因子IL-1β和IL-18水平，表明其可能通过NLRP3炎性小体介导的机制保护神经元[54]。

6 小 结

近年来，炎性小体与缺血性脑卒中的相关性研究越来越广泛，越来越多的炎性小体被证明与缺血性脑卒中发病关系密切，其发病机制的相关性逐渐明晰，并逐步开始靶点治疗的研究。现在已有针对单个靶点的研究，但对缺血性脑卒中发病后的整体生理调节网络的研究仍较不足。炎性小体与缺血性脑卒中发病及中医治疗缺血性脑卒中与炎性小体的机制处于初步探索阶段，仍需进一步深入研究。