锁阳多糖通过激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化

胡俊 谈荣珍 袁忠 杨盼盼 张楚焌 张斌 沈云峰

1南昌市洪都中医院骨伤七科（南昌 330008）；2南昌大学第二附属医院内分泌代谢科（南昌 330006）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种主要好发于绝经后妇女、常见的系统性骨骼疾病，其特征是骨微结构损伤或骨量减少，最终导致骨脆性增加和骨折风险上升［1］。目前国内40岁以上的人群中被确诊为骨质疏松症占3.2%，65岁以上老年人群的确诊率则达到了惊人的32.0%［2］。所以，骨质疏松症的防治具有重要的社会和经济意义。而目前双磷酸盐类药物作为主要的抗骨质疏松治疗手段，常伴随着患乳腺癌，下颌坏死或不典型股骨骨折等副作用［3］。因此，中药在骨质疏松症中的治疗作用逐渐受到重视，其疗效也被得到越多临床和基础研究的证实［4-5］。

锁阳为具有补肾益精作用的锁阳科植物，多见于新疆、青海、内蒙古等地的，也常作为治疗骨质疏松的中药方剂中的重要组成［6］。虽然锁阳多糖（cynomorium songaricum polysaccharide，CSP）作为锁阳的主要有效成分之一［7］，但其促进成骨细胞分化的作用仍未得到充分地阐明，有待进一步深入研究。PI3K/Akt通路是一种在哺乳动物中具有广泛调控作用的通路，对多种细胞的增殖和凋亡都起着重要作用［8-9］。 激活的蛋白激酶B（Akt）可磷酸化糖原合酶激酶3β（GSK3β），并进一步调控Wnt/β-catenin通路，从而对骨代谢过程产生影响［10-11］。本研究目的在于观察CSP对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，并进一步验证CSP是否通过调控PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路起效。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 从中国科学院上海细胞所细胞库购入的MC3T3-E1细胞株。CSP从宁夏香草生物技术有限公司购入；成骨细胞矿化结节茜素红染液和β-catenin免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；NVP-BEZ235（BEZ）购自Selleck公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自日本Takara公司；Western Blot抗体购自Cell signaling公司。蛋白免疫印迹所用的电泳仪/电转仪和实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法检测MC3T3-E1的细胞活性

利用MTT试验来观察不同浓度的CSP（0、25、50、100 μg/mL）对生长期对数期的MC3T3-E1细胞活力的影响。每组设3个复孔。按说明书流程在CSP干预后的第1、3、5、7天，使用酶标仪在490 nm波长下测量吸光度，以定量观察MC3T3-E1的增殖活力。

1.2.2 茜素红染色 将生长至对数期的MC3T3-E1细胞种于24孔板中；24 h后待细胞贴壁，改用成骨诱导培养基（10 mmol/L β甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸、1×10-8mol/L地塞米松）培养，并根据不加CSP、加入100 μg/mL CSP、同时加入100 μg/mL CSP及50 μmol/L BEZ，将细胞分为Con组、CSP组及CSP+BEZ组。每3 d换液1次，干预14 d后对各组细胞进行茜素红染色，显微观察每组的矿化结节情况。

1.2.3 Real-time PCR测定相关成骨分化mRNA的表达水平 在6孔板中，用不含、含100 μg/mL CSP、100 μg/mL CSP 及 50 μmol/L BEZ 的成骨诱导培养基进行培养MC3T3-E1细胞，每3 d换液。待细胞成骨分化14 d后，提取细胞的总RNA，并进行cDNA的逆转录与扩增。Real-time PCR引物序列如下：GAPDH-正义链5'-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3'，反义链5'-CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3'；Runx2-正义链 5'-GCTT-CATTCGCCTCACAAAC-3'，反义链 5'-GTAGTGA-CCTGCGGAGATTAAC-3'；Osteocalcin-正义链 5'-AAATAGCCCTGGCAGATTCC-3'，反义链5'-CAGC-CTCCAGCACTGTTTAT-3'；β-catenin-正义链5'-CT-TCACCTGACAGATCCAAGTC-3'，反义链5'-CCTTCCATCCCTTCCTGTTTAG-3'；Collagen I-正义链 5'-CTAAAGGCGAACCTGGTGAT-3'，反义链5'-TCCAGGAGCACCAACATTAC-3'。反应条件设置为：95℃预变性10 min，95℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共扩增40个循环。通过Ct值计算2-△△Ct结果，将目的基因的结果与GAPDH内参基因结果相除以标准化mRNA的表达水平。

1.2.4 Western Blot检测相关蛋白 干预方式同1.2.2，每组含3组重复。14 d后通过RIPA裂解液提取孔内的蛋白，进行蛋白浓度计算后，配置好10%的蛋白电泳胶后，每孔加入20 μL蛋白样本进行电泳，随后进行转膜、封闭和一抗过夜孵育。其中鼠抗人一抗：Runx2、Osteocalcin、Collagen Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、βcatenin、β-actin；室温下二抗孵育2 h并用TBST洗膜后，使用ECL曝光液进行曝光，分析条带的曝光强度。

1.2.5 免疫荧光检测β-catenin的表达 待细胞成骨分化14 d后，去除培养基，加入4%多聚甲醛固定细胞15 min，并使用0.1%的曲拉通透膜20 min。每孔细胞经历20 min血清封闭后，加入β-catenin一抗放置于4℃冰箱中过夜。次日加入荧光二抗在室温条件下孵育2 h；经DAPI避光染色2 min后，在暗室内通过荧光显微镜进行拍照。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有数据均以（±s）表示，两组间计量资料的比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSP浓度对MC3T3-E1细胞增殖的影响

MC3T3-E1细胞在不同浓度的CSP干预7 d后，未见明显细胞毒性；与其他浓度比较，100 μg/mL CSP在1～7 d里，促细胞增殖效果均更加明显（P＜0.05）。见图1。

图1 不同浓度CSP对MC3T3-E1增殖影响Fig.1 Effects of CSP at different concentrations on the proliferation of MC3T3-E1

2.2 CSP对MC3T3-E1成骨分化影响 CSP干预14 d后，钙化结节明显增多，面积显著高于对照组（P＜0.01），但加PI3K阻断剂后CSP的促进作用明显被减弱（P＜0.01）。见图2。

图2 CSP干预14 d对MC3T3-E1成骨分化的影响Fig.2 The effect of CSP for 14 days on osteogenic differentiation of MC3T3-E1

2.3 CSP对相关成骨分化mRNA表达的影响

CSP干预 14 d后，Runx2、β-catenin、Osteocalcin、Collagen I mRNA的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）；但是加入PI3K阻断剂干预后，CSP对成骨相关mRNA表达的促进作用被明显削弱（P＜0.05）。见图3。

图3 CSP干预14 d对MC3T3-E1细胞成骨分化标志物的影响Fig.3 The effect of CSP for 14 days on osteoblastic differentiation markers of MC3T3-E1 Cells

2.4 CSP对成骨相关蛋白的影响 CSP干预14 d后，Runx2、Collagen I、Osteocalcin的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）；但是PI3K阻断剂明显逆转CSP对成骨相关蛋白的促进作用（P＜0.05）。见图4。

图4 CSP干预14 d对MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白的影响Fig.4 Effects of CSP at different concentrations on osteogenic differentiation-related proteins of MC3T3-E1 cells

2.5 CSP对PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白表达影响 使用CSP干预14 d后，Akt、GSK3β蛋白表达无明显变化；但PI3K、p-PI3K、Akt、GSK3β、β-catenin蛋白经CSP干预后表达水平均明显增加（P＜0.01）；而加入BEZ后则明显逆转了上述蛋白水平的增加趋势（P＜0.05）。见图5。

图5 CSP干预14 d对PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白的影响Fig.5 The effect of CSP for 14 days on PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin signaling pathway related proteins

2.6 CSP对β-catenin蛋白核移位的影响 使用CSP干预14 d后，CSP组的β-catenin蛋白核位移现象明显多于对照组；而CSP+BEZ基本观察不到核位移。见图6。

图6 CSP对β-catenin蛋白核移位的作用Fig.6 The effect of CSP on the nuclear translocation of β-catenin protein

3 讨论

本研究经PCR、Western Blot等实验证明CSP可有效促进Runx2、β-catenin、Osteocalcin、CollagenⅠ这些成骨相关的mRNA表达水平，并且可促进β-catenin入核。Runx2在成骨早期阶段表达，对细胞的功能、成骨分化起到重要的调控作用；而Osteocalcin、Collagen I则是钙沉积和成骨分化的重要标志［12-13］。茜素红染色实验也从表型上证明了CSP促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用；CSP对成骨相关蛋白的促进作用也得到Western Blot实验结果验证。Western Blot实验则进一步揭示了这一促进作用背后可能涉及到PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路；加入PI3K抑制剂后上述作用均被明显逆转，因此反向加强验证了CSP促成骨分化的作用。

既往有研究指出，锁阳乙醇提取物可明显减少去卵巢大鼠的骨丢失，相关分子机制可能与血清成骨标志物ALP、OCN表达增加、破骨标志物TRAP、CTSK表达减少及GSH-PX和SOD、抑制MDA等氧化应激相关酶活性提高有关［14］。CSP也被证实具有改善去卵巢大鼠骨质疏松作用，作用机制可能与其提高雌激素水平、增加OPG/RANKL蛋白比例有关［15］。但未见其在PI3K/Akt通路相关领域的研究，基于此，本研究继续深入CSP促进成骨分化的可能机制。

在细胞增殖、分化、转移、凋亡等重要的过程，PI3K/Akt信号通路均广泛参与，并扮演至关重要的调控角色。新近研究也发现，骨髓间充质干细胞成骨分化的增加也与该通路的激活密切相关［16-17］。另一方面，抑制PI3K/Akt通路会降低ALP、OCN、Osterix、和Runx2的表达水平，因此抑制成骨细胞分化［18］。此外，GSK-3β作为该通路的关键调控靶点之一，Akt能够明显抑制GSK-3β的磷酸化致其失活，降低对β-catenin的降解作用，让更多的βcatenin入核促进下游的促细胞增殖、成骨基因表达［19-20］。提示PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路在成骨分化过程中至关重要。本研究也发现其参与了CSP的促成骨分化过程。

综上所述，本研究发现CSP促MC3T3-E1细胞成骨分化的机制与其增加成骨相关标志物表达、促进β-catenin入核有关，而其中PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路起到关键的调控作用，但仍待动物体内实验作进一步验证。