少精症、弱精症患者精浆miR-34c 的表达及意义

余亮亮 李朋

浙江省丽水市人民医院泌尿外科，浙江丽水 323000

研究显示，育龄期夫妇的不孕不育症发病率约为10%～15%，其中30%是由男性因素所引起，少精症、弱精症是导致男性不育的主要原因[1,2]。由于精液的异质性，多数少精症、弱精症患者的发病机制尚不明确[3]。精子中约有90%的基因处于活跃的转录状态，微小核糖核酸是一类内源性的非编码RNA，大小约19～26 个核苷酸，参与人体多种生理过程，在精原干细胞自我更新、分裂繁殖及精子的生长发育中发挥重要作用[4]。微小核糖核酸-34c（miR-34c）是miRNAs 家族的重要成员，有研究显示，miR-34c对正常睾丸功能、调节精子成熟和功能发挥重要作用[5]，故推测miR-34c 可能与少精症、弱精症患者的精液质量有一定的关系。因此，本研究通过检测精浆miR-34c 表达水平，探讨其与少精症、弱精症患者精液质量的关系，为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年1 月至2022 年3 月浙江省丽水市人民医院收治的135 例少精症患者为少精症组，156例弱精症患者为弱精症组，同期选取150 例育龄期健康男性为对照组。纳入标准：①少精症组、弱精症组患者均符合世界卫生组织相关诊断标准[6]；②年龄22～40 岁；③少精症组、弱精症组受试者的夫妻性生活正常且未采取避孕措施2 年以上而未能生育者；④配偶妇科检查结果正常；⑤对照组经精液标本检查结果正常；⑥受试者依从性好；⑦受试者均知情同意。排除标准：①泌尿生殖系统感染；②其他原因导致的男性不孕如隐睾、染色体异常、化疗等；③采样期间吸烟、酗酒等；④合并其他慢性疾病；⑤造血系统疾病；⑥精神疾病患者；⑦射精障碍者。少精症组受试者年龄 24～40 岁，平均（33.15±6.32）岁；体质量指数21～29kg/m2，平均（25.48±2.67）kg/m2；弱精症组受试者年龄22～39岁，平均（31.86±6.89）岁；体质量指数20～29kg/m2，平均（26.04±2.54）kg/m2；对照组受试者年龄22～40 岁，平均（32.85±5.36）岁；体质量指数22～29kg/m2，平均（25.77±2.47）kg/m2。三组受试者的年龄、体质量指数比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经浙江省丽水市人民医院伦理委员会审核批准（批件号：201912-003）。

1.2 研究方法

1.2.1 精子样本采集与制备 样本采集前禁欲1 周，采用手淫法取精液于无菌取精杯中，于37℃恒温箱中静置30min，至完全液化后进行常规精液检查，以1500 转/min 离心10min，12000 转/min 离心5min，取精浆2～3ml，-80℃保存备用。

1.2.2 常规精液质量检查 采用RT-S100 精子质量分析仪（深圳市瑞图生物技术有限公司）进行精液量、精子正常形态率、精子浓度、精子活力a+b 级百分比（a 级为精子运动状况极好，呈快速直线前向运动；b 级为精子运动状况很好，呈前向的曲线运动；a+b 级>50%为精子活力正常）及精子前向运动率检查。

1.2.3 精浆miR-34c表达水平检测 使用Trizol试剂盒（美国Invitrogen 公司）提取精浆总RNA，取200μl预处理的精浆样本，加入1ml Trizol 混匀，倒入装有氯仿、异丙醇和95%乙醇的离心管中，获得总RNA；用cDNA 合成试剂盒（北京天根生化科技公司）进行反转录，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTap，使用MA-6000 实时荧光定量聚合酶链反应仪（苏州雅睿生物技术有限公司）进行聚合酶链反应，反应条件为95℃，30s；95℃，15s；60℃，60s，40 个循环。每个样本设置3 个复孔，以焦碳酸二乙酯处理过的双蒸水为阴性对照，以U6 为内参，各引物扩增序列见表1。

表1 引物扩增序列

1.3 观察指标

比较三组的精浆miR-34c 表达水平、精液质量（包括精液量、精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率），并分析少精症、弱精症患者的精浆miR-34c 表达水平与精液质量的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行处理和分析，计量资料均行正态性检验，符合正态分布的以均数±标准差（）表示，多样本比较采用单因素方差分析和SNK-q 检验；采用Pearson 相关性分析少精症、弱精症患者的精浆miR-34c 表达与精液质量的关系，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组的精浆miR-34c 表达水平比较

三组的精浆miR-34c 表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），少精症组、弱精症组的miR-34c表达水平均低于对照组（P<0.05），少精症组与弱精症组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 三组的精浆miR-34c 表达水平比较（ ）

表2 三组的精浆miR-34c 表达水平比较（ ）

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 三组的精液质量参数比较

三组的精液量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；三组的精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；少精症组、弱精症组的上述指标均低于对照组（P<0.05），少精症组的精子总数、精子浓度低于弱精症组（P<0.05），少精症组的精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率高于弱精症组（P<0.05），见表3。

表3 三组的精液质量参数比较（ ）

表3 三组的精液质量参数比较（ ）

注：与对照组比较，*P<0.05；与弱精症组比较，#P<0.05

2.3 少精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液质量的相关性

Pearson 相关分析结果显示，少精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液量无相关性（P>0.05），与精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比及精子前向运动率呈正相关（P<0.05），见表4。

表4 少精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液质量的相关性

2.4 弱精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液质量的相关性

Pearson 相关分析结果显示，弱精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液量无相关性（P>0.05），与精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比及精子前向运动率呈正相关（P<0.05），见表5。

表5 弱精症组的精浆miR-34c 表达水平与精液质量的相关性

3 讨论

少精症、弱精症是导致男性不育的常见原因，好发于精索静脉曲张、内分泌异常、生殖道感染者[7,8]，其精液质量如精子总数、精子浓度、精子活力等降低，不仅影响不育者的身体健康，还带来严重的心理压力。本研究中少精症组、弱精症组的精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率均低于对照组，提示少精症、弱精症患者的精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率均低于正常水平，与于忠英等[9]的研究一致。另外，少精症组的精子总数、精子浓度低于弱精症组，但少精症组的精子活力a+b 级百分比、精子前向运动率高于弱精症组，提示少精症患者的精子总数、精子浓度更低，弱精症患者的精子活力a+b级百分比、精子前向运动率更低。少精症又称作精子减少症，主要表现为精子减少，但同时精子活力较正常水平减弱；弱精症主要表现为精子活动力低下，但同时精子数量较正常水平减少[10-12]。

本研究结果显示，少精症组、弱精症组的miR-34c表达水平均低于对照组，少精症组与弱精症组间无明显差异，提示少精症、弱精症患者的精浆miR-34c表达水平低于健康育龄期男性，推测miR-34c 可能参与少精症、弱精症的病理过程。miR-34c 是miR-34家族成员，miR-34 家族在进化中是一类保守的miRNA 家族，成熟的miR-34c 序列位于同一主基因原初转录本的外显子内[13,14]。Dorostghoal等[15]研究显示，不育者的精子miR-34c-5p 含量显著低于可育对照者，本研究结果与之一致，证实miR-34c 与男性不育的发生密切相关[16]。

本研究进一步相关性分析miR-34c 表达水平与精浆质量的关系，结果显示，少精症、弱精症患者的精浆miR-34c 表达水平与精子总数、精子浓度、精子活力a+b 级百分比及精子前向运动率呈正相关，提示miR-34c 表达水平与少精症、弱精症患者的精液质量存在紧密联系。王凡等[17]研究显示，MicroRNA-34b/c 位点rs4938723 与男性不育相关。Momeni等[18]研究发现，miR-34b/c 启动子区域的高甲基化可引起miR-34 家族异常低表达，进而影响精液质量。另有相关研究报道，miR-34c 具有相似或相同的种子序列，能够与3’-UTR 区域结合，从而对基因表达产生影响，同时调节患者的免疫系统，在精子的生成中发挥作用[19]。Welponer等[20]研究发现，miR-34a 和miR-34b/c 的启动子区域存在p53 结合位点，p53 能够直接调节miR-34 家族成员的表达进而影响生精细胞的凋亡、精母细胞的分裂等过程。基于以上研究猜测miR-34c 的表达水平能够影响精子质量，临床可尝试通过调控miR-34c 的表达治疗少精症、弱精症。

综上，少精症、弱精症患者的精浆miR-34c 表达水平低于正常水平，且与精液质量呈正相关，miR-34c的异常表达可能是影响少精症、弱精症患者精液质量的原因之一。