葛根芩连汤药效物质基础及质量控制研究进展

路立峰， 张媛媛， 李振兴， 蒋雨来

(山东药品食品职业学院药品技术研发中心，山东 威海 264210)

葛根芩连汤首载于张仲景《伤寒论》，原方名为葛根黄芩黄连汤，亦为后世《医方类聚》《医方集解》《伤寒大白》等医药典籍所收载，至近代《中国医药大辞典》始成葛根芩连汤方名。葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、炙甘草组成，具有表里双解、清热止利之功，为治热陷阳明、协热下利常用方，适用于脉促喘而汗出者[1]。现代研究表明，葛根芩连汤具有抗炎抑菌、降血糖、解热、降血脂、抗氧化等多种药理作用[2-6]，可用于治疗胃肠型感冒、糖尿病、细菌性痢疾、轮状病毒肠炎、溃疡性结肠炎等疾病[7-11]，其现代成方制剂有葛根芩连胶囊、片、口服液、颗粒、丸及微丸等，其中丸剂和片剂被2020年版《中国药典》一部收录。本文总结葛根芩连汤近十年来在化学成分、药效物质基础、制备工艺、鉴别、含量测定等方面的进展，以期为传统汤剂的传承、成方制剂的创新开发、质量控制与评价提供参考。

1 化学成分

葛根芩连汤的化学成分主要有黄酮类、生物碱类、皂苷类、酚酸类、香豆素类、木脂素类等[12-13]。其中，黄酮类成分主要来源于葛根、黄芩和甘草，以葛根素、大豆苷、黄芩苷、芒柄花苷、芒柄花素、汉黄芩素、槲皮素为主；生物碱类成分全部来源于黄连，含小檗碱、表小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀等；皂苷类成分主要来源于甘草，有甘草苷、异甘草苷、甘草皂苷G2等；此外，还有绿原酸、葛根香豆素、考迈斯托醇等酚酸类，香豆素类和木脂素类成分。

2 药效物质基础研究

2.1 基于成分导向的物质基础研究 成分导向型物质基础研究以获取结构明确的化合物为导向，多注重成分的获得，而忽视汤液药效物质的表达，但与网络药理学分析、质量标志物预测等技术相结合，可弥补其在方药系统性和整体性研究方面存有的不足，实现药效物质的分离和筛选。超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)是一种新兴技术，能实现未知成分的快速鉴定与分析，已逐渐用于快速识别三七、茯苓、秦艽等中药饮片的化学成分，然而在中药汤剂及成方制剂研究中鲜有报道。王婷婷等[12]通过构建化学成分数据库，对葛根芩连汤中化学成分进行UPLC-LTQ-Orbitrap-MS快速鉴定，完成整体和类群化学成分的推测及成分归属，共鉴定得到67个化合物，其中黄酮类36个、生物碱类12个、三萜及三萜皂苷类4个，另有酚酸类、香豆素类、木脂素类和苯乙醇苷类15个，该方法全面、快速、系统地实现葛根芩连汤化学成分的高分辨分析，为葛根芩连汤药效物质基础阐释和质量控制研究提供参考依据。

2.2 基于体外模型的药效物质研究 目前葛根芩连汤药效物质筛选研究的模型主要有大鼠肠外翻生物模型、四氧嘧啶致小鼠高血糖模型和链尿佐菌素(STZ)复合高脂饲料2型糖尿病模型等，前者主要用于体外肠道吸收的药效物质基础筛选，后两者则用于糖尿病的药效物质基础筛选。通过建立肠外翻生物模型，张华等[14]采用HPLC法分析葛根芩连汤及葛根芩连组、芩连组、芩连甘草组这3个不同配伍组的生物碱成分在肠道给药后的动态变化规律，研究表明，黄连碱、药根碱、小檗碱、巴马汀这4个组分在不同肠段的吸收均为线性吸收，符合零级吸收速率，其中小檗碱、巴马汀的最佳吸收部位为空肠，黄连碱、药根碱的最佳吸收部位为结肠，并且方中其他药能促进黄连生物碱类成分的吸收。王跃等[15]以肠道转运P-糖蛋白抑制剂维拉帕米为依据，进一步研究配伍对黄连生物碱肠吸收特性的影响，研究发现，各生物碱在各肠段的吸收均显著性增加，且葛根能有效促进十二指肠和空肠段生物碱成分的吸收，黄芩能增加回肠和结肠段黄连碱、小檗碱、巴马汀成分的吸收，阐明葛根芩连汤复方配伍机制及合理性。葛根芩连汤具有降低血糖的药理活性，王霜等[16]基于基线等比增减设计研究葛根-黄连药对不同配比对小鼠血糖的影响，结果发现，葛根-黄连药对剂量比为3∶8时，降低四氧嘧啶和STZ糖尿病模型血糖效果最佳，并能使正常小鼠血糖降低，对STZ所致糖尿病的血清总胆固醇、甘油三酯降低效果突出。建立在已知靶点基础上的体外药效物质研究虽能客观、系统的反映汤剂的作用机能，但却无法全面表达机体整体机能。

2.3 基于药动学的药效物质研究 葛根芩连汤成分多、靶点多、作用途径多，其整体药效作用特征的表达是研究的关键科学问题。王琦等[17]通过LC/MS/MS技术对葛根芩连汤42种入血的生物活性成分(标志物)进行分析和药动学研究，结果表明，甘草酸通过抑制P-糖蛋白提高小檗碱的渗透性，甘草酸与小檗碱配伍后，能增强其抗糖尿病的作用，使血糖下降46.9%，胰岛素水平较对照组升高40.8%，并呈剂量依赖性，该方法通过活性成分药动学的改变，揭示葛根芩连汤协同用药抗糖尿病的作用机制。毛莹等[18]发现，葛根芩连汤药效组分能降低胃排空速度、抑制小肠蠕动而达到良好的止泻作用。张艺竹等[19]通过液相色谱-串联质谱结合大鼠肠外翻及在体单向肠道灌流试验，研究葛根芩连汤不同配伍在大鼠体内药动学肠吸收，结果显示，全方配伍能促进葛根素、黄芩苷、小檗碱、甘草苷这4种成分在肠道中的吸收，全方组大鼠体内葛根素、黄芩苷、小檗碱AUC值升高，但同时加快肝药酶对甘草苷的代谢，使甘草苷AUC值降低，该结果通过药动学阐释葛根芩连汤方配伍的原理和机制。张启云等[20]灌胃给予SD大鼠葛根芩连汤的11种入血成分并进行HPLC-ESI-MS/MS检测及成分归属，采用曲线下面积(AUC0～∞)自定义权重系数建立整合药动学模型，结果表明，总黄酮、总生物碱类的药动学参数t1/2、AUC0～∞分别为6.08 h、30.00 mg/L·h和28.86 h、1.07 mg/L·h。该方法从多成分分类整合药动学的角度，反映出同类化合物整体在生物体内的药动学变化规律，但该方法在表达整体药效作用的关联上，尚存有一定的欠缺。

2.4 基于血清代谢组学的药效物质研究 汤剂药效的发挥，与吸收入血成分密切相关，吸收入血成分的鉴定和分析，是当前研究的热点，也是真实反映药效物质的核心。张敏等[21-22]采用氢核磁共振代谢组学技术，研究葛根芩连汤对2型糖尿病的干预和高果糖诱导胰岛素抵抗大鼠粪便代谢。张敏等[21]鉴定得到15个T2DM潜在生物标志物，并发现葛根芩连汤能不同程度地回调14个标志物，认为其可通过调节能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等途径发挥作用，此结果通过研究大鼠血清中内源性代谢物的变化，从代谢组学的角度为其临床应用提供了实验数据和理论基础。汪双红等[22]发现，葛根芩连汤能抵抗丙酸、乙酸、琥珀酸、牛磺酸和甘油水平升高，降低正丁酸、丙氨酸和谷氨酸水平，从而改善胰岛素抵抗引起的大鼠氨基酸代谢、脂肪酸氧化、肠道微生物代谢等代谢紊乱状态。该方法虽能客观真实地反映出入血成分的药效物质基础，但却忽视了动物机体差异性带来的影响，对无法入血的成分或入血后代谢的部分成分，不能实现有效的辨识与筛选。

2.5 基于谱效关系的药效物质基础研究 谱效关系是基于通过化学成分分析，构建化学成分群的特征指纹图谱，再结合适宜的药效评价模型，实现中药指纹图谱和药效学的有效关联，用于评价药效物质基础的研究。它受化合物对照品种类及色谱分离技术的限制，尚不能全面表征化学成分的指纹特征。刘文等[23]在超高液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)指纹图谱基础上，采用主成分分析及灰色关联度分析，确定葛根素、大豆苷、黄连碱、表小檗碱、盐酸药根碱、黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵等主要成分的共同作用，是葛根芩连汤改善湿热内蕴型溃疡性结肠炎大鼠模型血清及组织液TNF-α影响的药效信息物质。

3 质量控制

目前，葛根芩连汤质量控制的研究内容主要集中在粉碎、煎煮、纯化精制等关键制备工艺，鉴别和含量测定这3个方面，而其出膏率、水分、浸出物、污染物检查等物质基准研究的文献报道则少见。

3.1 制备工艺

3.1.1 超微粉碎 超微粉碎是利用机械力或流体动力，使药材细胞破壁，获取均匀超微粉末的方法，具有可控性强、适用范围广的特点，并能有效提高体外溶出度和节省药材。刘蕊等[24]研究表明，葛根芩连汤300目超微粉比细粉中的葛根素、黄芩苷溶出含量分别提高56.10%、41.73%，能显著增强有效成分的溶出度。该研究为药材的可持续化利用和减少服用量方面提供了有益参考。

3.1.2 煎煮 煎煮是传统汤剂获取有效物质或有效物质群组的主要手段，也是决定汤液安全有效的关键环节，更是提高汤液质量稳定均一的控制措施。对葛根芩连汤煎煮方面的研究集中在煎法、加水量、煎煮时间、煎煮次数、煮取量等。《伤寒论》中有葛根芩连汤“以水八升，先煮葛根，减二升，内诸药，煮取二升”的记载，周娜娜等[25]发现，加水量与煮取量的多少能反映出对煎煮时间的把控，并推测出《伤寒论》中葛根芩连汤的煎煮时间应为45 min。王晓军[26]考察合煎、分煎及共煎对葛根芩连汤有效化学成分的影响，发现分煎剂中葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀平均百分含量为1.93%、0.60%、0.14%、0.07%，明显高于合煎剂及共煎剂，由此推荐分煎法制备葛根芩连汤。文谨等[27]对不同量值(一两等于13.8 g和一两等于3 g)下的葛根芩连汤，进行经方本原和现代常规煎煮法比较，发现高量值时，本原法煎煮的汤剂有效成分煎出量和干膏率均低于现代常规法，而低量值时，则均优于现代常规法，提示有效成分的煎出量未能与药材的使用量成相应的倍数，并为此方的古为今用提供了参考依据。王立等[28]考察葛根芩连汤、黄芩单煎液、黄连单煎液这3种煎煮方式，发现葛根芩连汤中其他成分能对黄芩苷、小檗碱的入血吸收产生显著影响，并能延长黄芩苷在体内的作用时间。张家成等[29]以葛根素、汉黄芩苷、小檗碱、大豆苷、甘草酸铵、甘草苷、巴马汀等主要成分溶出量为评价指标，确定最佳煎煮工艺为9倍量水，煎煮时间50 min，发现在相同煎煮时间和次数的条件下，主要成分的溶出量随加水量的增多而呈现上升趋势，9倍的加水量为明显拐点；在相同加水量和煎煮次数条件下，主要成分的溶出量随煎煮时间的延长亦呈现上升趋势，50 min为明显改变点，但在80 min时有些成分的溶出会减少。章军等[30]基于中医配伍理论，对君臣佐使药分配权重系数，进行葛根芩连汤提取工艺的综合评价，确定最佳煎煮工艺为8倍量水提取3次，每次1 h，此工艺稳定可靠、重复性高、稳定性好，为临床用药煎煮和工业生产提供参考。此外，还有动态优化法优化葛根芩连汤提取工艺研究报道。

3.1.3 微生物发酵 微生物发酵是传统中药与现代生物技术相结合的新兴技术，在提高有效成分含量、获取新的活性物质、降低副作用、促进生物利用度等方面具有明显优势。杜晨晖等[31]通过酿酒酵母ATCC9763、GIM2.9，采用两步培养法，对葛根芩连汤进行发酵，紫外-可见分光光度法测定发酵样品总黄酮和总生物碱的含量，结果表明，此方法能够降低细胞壁的阻滞作用，促进有效成分的溶出，并使总黄酮含量分别提高32.90%、30.20%、总生物碱含量分别提高24.91%、30.89%，为中药复方制剂的研究与开发提供一种新的思路。李津等[32]对葛根芩连汤进行固态发酵，以发酵产物对酵母静息细胞的活性作为评价指标，正交试验优选确定最佳工艺为1∶1的生药量和面粉量，高温高压灭菌，接种15 g/L酵母液，35 ℃发酵5 d，此方法制备的发酵产物生物活性强，能增强酵母静息细胞葡萄糖代谢能力，并为后期大规模工业化生产提供依据。

3.1.4 壳聚糖絮凝沉降 壳聚糖絮凝沉淀是利用壳聚糖的高吸附性能，与被分离组分结合形成架桥，获得沉淀絮状物的一种分离技术。孙星等[33]优选葛根芩连汤壳聚糖絮凝沉降工艺，确定葛根芩连汤中黄酮和生物碱类成分的最佳纯化条件为药液质量浓度0.78 g/mL，壳聚糖加入量10%，药液pH值6，并进行沉降效果和指纹相似度比较，结果表明，该方法与原药液HPLC图最为相似，对小檗碱的损失量较大，而对葛根素、黄芩苷的保留率较高，并认为壳聚糖絮凝沉淀能改变药液中有效成分之间的组成比例，进而改变药效性质，应慎重选择壳聚糖絮凝沉降作为葛根芩连汤的精制工艺。

3.2 鉴别 除薄层色谱鉴别外，色谱指纹鉴别技术如HPLC指纹图谱、UPLC-MS/MS指纹图谱、红外指纹图谱等，也较多的应用在葛根芩连汤的质量控制研究中。

3.2.1 HPLC指纹图谱 安叡等[34]采用RE-HPLC法，以甲醇-水(含0.5%甲酸和0.5%三乙胺)为流动相，梯度洗脱，在270 nm波长下以葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱为药材参照峰，得到葛根、黄芩、黄连的特征峰群，建立葛根芩连汤和药材的数字化色谱-指纹图谱(HPLC-DFPS)，实现对葛根、黄芩、黄连的鉴别，但该方法受制于对照品种类的局限，无法对方中诸药协同产生的新成分指认，尚不足以实现指纹图谱主要色谱峰的全面定性。宋丽军等[35-36]利用HPLC-DAD检测，在250、280、346 nm波长下识别葛根芩连汤23个特征峰，明确其中12个色谱峰的归属，实现对全方4味药多成分的同时测定，此鉴别方法色谱信息丰富、分离度好、分离时间短，可用于成分的快速鉴定，并有助于葛根芩连汤及各组分的质量控制。

3.2.2 UPLC-MS/MS指纹图谱 UPLC-MS指纹图谱具有分离性能强、分离度好、分辨率高的优点，能全面反映待测组分的化学成分信息，可系统表明药物成分的整体观。王钰乐等[37]建立葛根芩连汤UPLC-MS/MS指纹图谱分析方法，以盐酸小檗碱为参照峰，UPLC-TQMS检测，定性鉴定出8个共有峰，确认39个特征指纹峰的归属，其中13个来源于葛根，17个来源于黄芩，6个来源于黄连，3个来源于炙甘草，该方法操作简单、信息量丰富、灵敏度高、分离效果好，为该汤剂的质量控制提供参考依据。

3.2.3 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)指纹图谱 与液相色谱指纹图谱相比，红外光谱指纹图谱具有对样品无损伤、不需摸索色谱条件、可获取整体宏观信息的优势，既能反映中药内在的物质基础,又能在宏观上有效控制中药整体质量。因其专属性高，广泛应用于汤剂的品质评价、组方与拆方机理研究中。越来越多的研究者采用FT-IR技术探究葛根芩连汤红外指纹特征，徐蓓蕾等[38]确认1 727、1 614、1 509、1 448、1 362、1 272、1 031、838、767、582 cm-1等区域为其红外指纹特征峰；石玉娟等[39]在研究配伍对葛根芩连汤总多糖含量影响变化时，发现葛根、黄连两药配伍后，多糖红外特征官能团增多，能增加多糖溶出含量；任蕾等[40]根据红外指纹吸收峰的强弱推测药效，显示全方配伍得到的IR指纹特征峰最强最多，甘草能显著促进葛根素的溶出，黄连能抑制黄芩素的溶出，但黄芩有助于黄连药效的发挥。

3.3 含量测定

3.3.1 HPLC法 HPLC法简便快捷、专属性强、效率高，已广泛的应用于汤剂与成方制剂的质量控制中。相关学者已采用HPLC-DAD检测，实现对葛根芩连汤全方四药中的葛根素、大豆苷、黄芩苷、甘草苷、黄连碱、药根碱、小檗碱、盐酸表小檗碱、巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、大豆苷元、甘草酸铵这14种药效组分含量的同时测定，并完成药效组分间的结构比确认，可用于全面评价和控制葛根芩连汤质量[41-44]。

3.3.2 UPLC法 张华等[45]将UPLC法与DAD(PDA)检测结合，在10 min内快速测定葛根芩连汤肠外翻囊样品中葛根素、大豆苷、甘草苷、野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷等6种黄酮类成分的含量，该方法操作简便、快速准确、灵敏可靠，并为葛根芩连汤大鼠肠吸收动力学研究提供参考。

3.3.3 苯酚-浓硫酸法 多糖是具有广泛的抗肿瘤、抗微生物、抗氧化、降血脂和调节免疫等生物学活性[46]。石玉娟等[39]采用苯酚-浓硫酸法测定葛根芩连汤不同配伍对总多糖含量的影响，研究表明，葛根与黄芩、甘草、黄连不同配伍时，多糖含量分别为1.46%、1.48%、0.99%，该研究为葛根芩连汤多糖临床药效的发挥提供数据支持。

3.3.4 ICP-AES法 微量元素离子对中药汤剂功效的表达具有重要意义，若超出限度或过多，就会危害人体健康。尹爱武等[47]对葛根芩连汤进行不同煎煮时间的ICP-AES法无机元素测定，结果表明，煎煮时间为60 min时煎液中Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu、Sr含量分别为473.39、594.04、4.71、40.33、5.40、1.75、4.93 μg/g，与90 min的煎液差别不大，且2种煎液中均未检测到Co、Ni、Cd、Pb这4种有害元素，该方法为葛根芩连汤的质量控制和临床应用提供参考依据。

综上所述，在测定成分的选择上，以药效活性物质为导向，表现汤液质量；在成分的测定上，趋向多成分的同时测定，实现汤液质量控制；在测定技术的选择上，以快速、全面、准确为目标，评价汤液控制质量；在汤液的临床使用上，以安全、有效为目的，突出汤液药品特性。可以预测的是，针对葛根芩连汤基准物质研究的不足，当以《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》为技术要求，完善相关研究，夯实制剂质控基础，进而促进该方制剂的注册，推进品种的二次开发。

4 结语

中医药学是一个伟大宝库，应当努力发掘，加以提高。随着中医药发展上升为国家战略，以葛根芩连汤为代表的经典名方的现代化是中药现代化的重要组成部分，也是传承精华的主阵地，更是守正创新的突破口。汤剂的研究，虽在化学成分、药效物质和质量控制方面取得了一定的发展，但依然道阻且长。基于此，以下几点仍需思考：①汤剂研究应突出临床价值导向。汤剂来源于临床，应用于临床，反馈于临床，临床疗效是其生命线，也是检验汤剂质量优劣的标准线，故其研究设计当以临床疗效为中心，以药效物质基础研究和质量控制研究为2个基本点；以药效物质基础研究探讨其作用机制，表达释其功能主治；以汤剂质量控制研究进行制剂研发，保障其制剂属性，协同促进临床疗效。②药效物质基础研究是阐释临床功效和作用本质的核心，其研究的思路和方法也呈现出多元化、多样化，但仍有一定程度的不足和局限。对汤剂药效物质基础的研究，一是坚持动态发展理念，引入计算机现代技术，对药效物质进行精准辨识、筛选与预测，再结合真实世界的药理试验，评价其真实性，寻找到能代表其药效的物质基础；二是坚持中医整体观念，建立多学科交融，多层次筛选和多维评价的研究模式，实现方证效应表达，全面、系统地揭示汤剂的物质基础，阐释其作用机制和配伍规律。③在质量控制研究中，借鉴新技术、新方法，引进新设计、新理念，进行处方筛选、工艺优化、稳定性研究、临床安全性评价等全方位、动态性的过程控制评价，实现传统汤剂的整体观质量评价。在制剂研发中，从药味来源、工艺设计、质量标准到物质基准研究，遵循临床用药需求，促进整体质量传递，推进中药质量控制的整体转变；在标准制定上，淘汰能耗高、成本高、污染大的检验方法，坚持绿色、环保、低毒的新模式，构建绿色集成标准，增强科技与经济价值；在原料把控上，从种植、采收、加工到流通，严格控制药材质量，建立可追溯的绿色质量控制体系；在制剂生产中，从投料、提取、制备到包装，严控每一生产环节，明确关键质量属性，建立全过程的绿色制造质量控制体系，培育和造就一批临床价值高、科技含量足、竞争力强的名优品种，推进中医药的高质量发展。