银杏叶提取物防治内耳疾病作用机制的研究进展

王青玲， 张梦娴， 王庆林， 郭向东

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

银杏叶提取物(extract ofGinkgobiloba，EGB)是从银杏的干燥叶中提取的含有黄酮类、萜类内酯、有机酸等在内的一百多种化学成分的混合物。EGB761是国际上按德国Schwabe专利工艺生产的标准银杏叶提取物，商品名为金纳多。它是利用醇溶液从银杏的叶中提取出的混合物，成分复杂，含有24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯。既往研究发现，银杏叶提取物可通过清除自由基、改善凝血功能和血流动力学、降低炎症反应等多种机制延缓神经退行性疾病、心脑血管疾病。近年来研究发现，银杏叶提取物在治疗感音神经性耳聋、耳源性眩晕等内耳疾病方面疗效显著，但其对内耳疾病的保护机制尚不明确，因此，本文就银杏叶提取物防治内耳疾病的作用机制进行综述。

1 银杏叶提取物对老年性耳聋的保护作用

老年性耳聋主要分为感音性、神经性、血管性、耳蜗传导性四种类型。感音性老年性耳聋病变损伤在内、外毛细胞(hair cell，HC)，神经性老年性耳聋是耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell，SGC)和神经纤维的退行性变，血管性老年性耳聋病变在血管纹，耳蜗传导性老年性耳聋病变在基底膜。老年性耳聋与内耳微循环、谷氨酸过度释放、氧化应激介导的炎症反应、细胞凋亡增加和自噬降低等密切相关。杜政德等[1]发现，老年性耳聋大鼠的氧化应激蛋白表达升高而抗氧化蛋白明显下调，表明老年性耳聋与氧化应激存在密切的关系。He等[2]认为，衰老会激发炎症级联反应从而损伤耳蜗，这种炎症反应主要是通过各种耳蜗细胞(螺旋韧带纤维细胞、HC和邻近的支持细胞等)引起炎症介质的上调，其次是通过内淋巴囊或螺旋静脉从循环系统中迅速募集和浸润炎症细胞，表明炎症反应在老年性耳聋病程中起着不可忽略的作用。银杏叶提取物可通过上述多重途径降低耳蜗HC、SGC及血管纹等的损害，最终延缓老年性耳聋的发生发展过程。

杨琴等[3]研究发现，银杏叶提取物联合巴曲酶治疗老年性耳聋能改善患者的听功能和血液黏稠度。吴毅超[4]发现，银杏叶提取物和耳聋左慈丸治疗能稳定老年性耳聋患者的血流动力学、改善血管内皮细胞功能，保障耳蜗组织的养分供给，有效提高治疗有效率。银杏叶提取物可能是通过减轻耳蜗血管闭塞，减少炎性因子释放，提高线粒体氧化呼吸链复合体I、IV和V的活性和氧化磷酸化水平，恢复耳蜗氧化还原平衡功能，改善衰老耳蜗微循环，进而延缓听力损失和耳蜗损伤[5]。另外，老年性耳聋患者体内谷氨酸释放增加，导致Na+、Ca2+大量内流，少量K+流出，伴有Cl-和水分子进入细胞内，导致树突急性水肿，从而引起内耳细胞损伤和功能障碍，银杏叶提取物可竞争性拮抗血小板活性因子(platelet-activating factor，PAF)的膜受体，阻断PAF诱导的谷氨酸过度释放，对抗兴奋性神经毒素诱发的组织学和形态学改变，进而降低内耳神经细胞对谷氨酸引起的神经毒性的敏感性[6]。黄海林等[7]发现，银杏叶提取物可减少mtDNA的氧化损伤，抑制老年大鼠听觉器官线粒体DNA4834bp缺失突变，维持神经元细胞线粒体的形态和数目,从而延缓大鼠老年性耳聋的进展。炎性因子(如IL-1等)易诱发耳蜗神经细胞的凋亡，银杏叶提取物可降低耳蜗神经细胞炎性因子的释放，抑制线粒体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的活性来阻止衰老耳蜗的细胞凋亡[8]。同时，c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)参与衰老耳蜗的凋亡过程，其加速线粒体释放细胞色素C(Cyt c)，促进细胞凋亡。银杏叶提取物一方面是通过抑制ROS的聚集及线粒体去极化，显著减轻氧化应激，降低Cyt c释放；另一方面是通过抑制IL-1诱导的趋化因子，减少Cyt c释放。Cyt c下调抑制caspase-3的启动及级联放大反应，促进抗凋亡因子Bcl-2转录，抑制促凋亡因子Bax释放，使促凋亡的c-JNK失活和降解，从而“关闭”下游靶c-JNK，抑制凋亡途径，保护老化的耳蜗神经元细胞[9]。研究发现，银杏叶提取物可通过激活Akt/mTOR途径来调控自噬，增加神经突起生长，从而改善阿尔茨海默病的症状[10]，但银杏叶提取物能否通过增强耳蜗神经细胞的自噬，进而延缓老年性耳聋的研究尚未见报道，需要进一步的研究。

2 银杏叶提取物对突发性耳聋的保护作用

突发性耳聋是耳鼻喉科常见的急性症状，其发病机制尚不清楚。据报道，免疫系统障碍及电解质紊乱诱导的耳蜗微循环异常可能与突发性耳聋的生理病理机制息息相关[11]。细胞因子(如IL-1β、IL-2和TNF-α)及炎性细胞包括巨噬细胞、T淋巴细胞等，在调节内耳的免疫反应中起着重要作用。这些细胞因子或炎性细胞被刺激释放后，部分被循环系统招募进入内耳，进而对内耳组织造成不可逆性损伤[12]。血管纹和血管周围驻留的黑素细胞样巨噬细胞构成的血迷路屏障，是维持耳蜗内电位所必需的，两者均具有Na+-K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-转运蛋白，K+通过一系列离子通道及转运蛋白进入内淋巴，使内淋巴液维持低Na+和高K+状态，从而维持内耳稳态。当上述K+离子的循环代谢发生障碍时，会使耳蜗内电位(endocochlear potential，EP)改变，最终诱发突发性耳聋。

近年来，通过多中心、大样本的临床研究发现银杏叶提取物治疗突发性耳聋的临床效果令人满意。北京脑血管病防治协会[13]推荐采用银杏叶提取物联合糖皮质激素治疗突发性耳聋患者，可以明显改善耳聋、耳鸣症状，且不良反应少。同时，国外一项随机、双盲、多中心的前瞻性研究发现，EGB761联合类固醇治疗突发性耳聋患者，可显著提高患者的言语识别率且具有很好的安全性[14]。王洪波等[15]发现，银杏叶提取物可作用于细胞膜上的PAF，拮抗PAF诱导的血小板聚集及血栓形成，刺激内皮舒张因子舒张迷路动脉，减轻供血不足导致的内耳损伤，对于突发性耳聋的疗效优于丹参。同样，王慧敏等[16]发现突发性耳聋患者血清免疫球蛋白和C反应蛋白(CRP)表达升高，NO和超氧化物歧化酶(SOD)合成释放降低，提示突发性耳聋的发病机制与免疫反应及炎症反应有关，而银杏叶提取物联合高压氧治疗突发性耳聋患者后，患者体内免疫球蛋白及CRP水平较低，NO、SOD水平升高，说明银杏叶提取物联合高压氧治疗可提高血清抗体浓度，具有改善免疫功能、减轻炎症反应、降低氧化应激、抑制细胞膜脂质过氧化等作用，从而减轻听力损失和耳蜗损伤。黄巧等[17]通过中药系统药理学分析平台获取银杏叶提取物的主要药理学成分包括槲皮素、儿茶素、银杏内酯等活性化合物，从GeneCards数据库获得银杏叶提取物活性成分对应的靶点及突发性耳聋相关的靶点，构建药物成分-靶点-疾病网络，发现银杏叶提取物可能靶向作用于钾电压门控通道、脑源性神经营养因子、脂联素、一氧化氮合酶、caspase-3等多个靶点，参与细胞稳态、凋亡与自噬的调控等多个生物学过程，并通过AMPK、TNF、p53、T细胞受体、PPAR等多条信号通路调节内耳K+和Ga2+平衡、炎症反应、氧化应激、线粒体功能、细胞凋亡，进而达到治疗突发性耳聋的目的。虽然银杏叶提取物已被列入突发性耳聋的诊疗指南，但由于目前缺乏有效的突发性耳聋动物模型，针对银杏叶提取物作用于突发性耳聋机制方面的研究多局限于临床研究，阻碍了银杏叶提取物治疗突发性耳聋机制的深入研究。

3 银杏叶提取物对药物性耳聋的保护作用

药物性耳聋是指某些药物的耳毒性所导致的内耳细胞变性和听觉障碍。大量报道发现，银杏叶提取物对顺铂、水杨酸钠、庆大霉素等耳毒性药物所致的听力损伤有保护作用，其作用机制如下。

3.1 顺铂 顺铂是一种高效、应用广泛的化疗药物，但顺铂可损伤耳蜗HC，诱导SGC变性，间质细胞丢失，导致不可逆的感音神经性听力损失[18]。

Dias等[19]对接受顺铂治疗的癌症患者进行前瞻性、双盲、安慰剂试验研究，结果发现，EGB761具有显著的抗氧化作用，对顺铂导致的听力损伤具有一定疗效。银杏叶提取物可能是通过p53/NOX4/p66shc[20]、AMPK/SIRT1[21]和Akt-Nrf2-HO-1[22]等信号通路降低了耳蜗细胞的氧化应激水平，保护耳蜗组织免受顺铂的损伤。Ma等[20]发现，p53在调节HC中ROS的生成、解毒及细胞凋亡方面起着重要作用，顺铂治疗后，NOX4和p66shc的表达随着p53表达的增加而上调，从而产生细胞毒性作用。银杏内酯B可通过p53介导的NOX4/p66shc信号通路减少超氧化物的产生，降低内耳细胞凋亡，对顺铂诱导的耳聋起到保护作用。雷文静等[21]发现AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能调节能量代谢、细胞稳态及氧化应激；SIRT1是AMPK下游的效应蛋白，与细胞的氧化应激、能量代谢密切相关。银杏叶提取物可通过激活AMPK/SIRT1信号通路，使HEI-OC1细胞的氧化应激水平降低，细胞活性提高，细胞凋亡减轻。研究表明核因子红细胞系2相关因子(Nrf2)及其下游的血红素加氧酶-1(HO-1)在细胞抗氧化防御系统中发挥重要作用，Akt可激活Nrf2-HO-1抗氧化途径。顺铂耳毒性抑制Akt活性，降低耳蜗HEI-OC1中Nrf2的表达，抑制Nrf2转录，阻断Nrf2-HO-1途径，导致ROS大量聚集，诱发氧化应激[23]。Ma等[22]发现，银杏内酯B对顺铂所致大鼠听力损失和前庭功能障碍有明显的保护作用，其可能是通过激活Akt信号，增强Nrf2-HO-1的抗氧化功能，减少ROS的产生，从而抑制线粒体凋亡，最终减轻顺铂对内耳的损伤。

3.2 水杨酸钠 水杨酸钠是阿司匹林的有效成分，易穿过血脑屏障，长期使用水杨酸钠会引起诸如感音神经性听力损失和耳鸣等副作用。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA-R)是位于内毛细胞(inner hair cell，IHC)和初级传入神经元之间的一种离子型谷氨酸受体，在水杨酸钠致聋大鼠模型中，大剂量水杨酸钠活化NMDA-R，伴随Ca2+表达上调，刺激Ca2+依赖性酶，钙超载降低线粒体膜电位，导致ATP合成受阻，能量供应不足，进而损害内耳神经细胞[24]。耳蜗SGC上NMDA-R被激活后，损伤线粒体，促进Cyt c等凋亡因子释放，诱发细胞凋亡，导致SGC毒性损伤，产生耳聋和耳鸣。银杏叶提取物对水杨酸钠引起耳聋的保护作用可能与抑制NMDA-R表达，降低Ca2+内流，维持线粒体膜稳定性，拮抗细胞凋亡等有关[25]。

3.3 庆大霉素 庆大霉素是最常用的氨基糖苷类药物，其耳毒性为人们所熟知。Sagit等[26]用雌性SD大鼠观察槲皮素对庆大霉素所致耳毒性的作用，发现槲皮素具有降低听性脑干反应(ABR)阈值和减弱HEI-OC1中caspase-3、caspase-9表达，表明槲皮素可减轻庆大霉素诱导的大鼠耳毒性和组织病理学损伤，对耳蜗细胞具有保护作用。

4 银杏叶提取物对噪声性聋的保护作用

噪声性聋是导致成年人耳聋最常见的原因之一，近年来，国内外研究发现银杏叶提取物具有抗炎和抗氧化活性，并能保护耳蜗免受噪音诱发的听力损失[27]。

谭君武等[28]将56例爆震性聋患者随机分为对照组与治疗组，与对照组比较，银杏叶提取物联合传统高压氧治疗组耳聋、耳鸣的症状明显改善，总有效率显著提高。Sjostrand等[29]发现，噪音暴露后，雌性SD大鼠耳蜗内ROS水平升高，引起细胞膜DNA突变和脂质过氧化，最终导致内耳的氧化应激损伤。EGB761可通过清除耳蜗中过量的ROS，终止自由基连锁反应链，减弱其对膜蛋白的攻击，减轻DNA损伤，促进DNA修复，从而延缓噪声性聋的发生和发展。Castaneda等[30]发现，噪音暴露后，耳蜗线粒体呼吸链被破坏,线粒体膜电位低于阈值，ATP生成受到抑制，能量供应不足会导致内耳神经细胞的损伤。EGB761治疗后可改善线粒体的水肿并减轻其损伤，从而缓解噪声性聋患者的听力损失并抑制耳鸣。Krauss等[31]使用EGB761治疗噪音暴露后的蒙古沙鼠，发现EGB761可通过维持线粒体膜稳定性，降低血液黏度，改善耳蜗血液循环，进而延缓耳聋、耳鸣的发生。董颖婕等[32]发现，银杏叶提取物能通过增强锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性，抑制ROS产生，减轻HC氧化应激，提高HC存活率，进而缓解脉冲所致噪声性聋大鼠的听功能下降。最近，该课题组人员通过对miR-183家族的研究，进一步证实EGB761对脉冲噪音所致大鼠听力损伤具有保护效应。miR-183家族表达下调可能是噪音性听力损失的重要因素，EGB761是通过增强噪音暴露后耳蜗miR-183的表达、减轻耳蜗机械损伤，从而保护和修复听力的[33]。另外，噪音后内耳中的促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，这些炎症因子可加重耳蜗HC损伤，银杏叶提取物对噪声性聋具有一定的保护作用，其机制可能与抑制IL-1β、IL-6、TNF-α释放有关[34]。总体来说，银杏叶提取物是通过降低炎症反应和氧化应激水平、调控micRNA等来保护耳蜗细胞免受噪音的损伤，然而噪声性聋的发病机制相当复杂，还与谷氨酸的兴奋性毒性及表观遗传学改变等引发的耳蜗带状突触病相关，因此银杏叶提取物对于噪声性聋的保护机制仍需进一步的研究。

5 银杏叶提取物对耳源性眩晕的保护作用

耳源性眩晕是指外周前庭系统感受异常引起的眩晕，涉及耳蜗、前庭、以及迷路外病变，主要包括良性阵发性位置性眩晕(BPPV)、梅尼埃病、迷路炎、前庭神经元炎等。耳源性眩晕的病因涉及内淋巴代谢障碍、免疫因素、感染等，其中血液流变学异常是耳源性眩晕病因之一。

临床上应用银杏叶提取物治疗耳源性眩晕已有数十年的历史并取得了较好的临床疗效。研究发现，EGB761可抑制血管平滑肌细胞与交感神经末梢释放去甲肾上腺素，舒张血管平滑肌，增加内耳末梢小动脉流量，降低血液黏稠度及血液运行阻力，改善前庭器官微循环，减轻眩晕症状，保护前庭功能[35]。BPPV是耳源性眩晕中发病率最高的一种疾病，耳石复位法是目前治疗BPPV最安全、有效的方法，但部分患者复位成功后仍有头晕等残余症状存在。姚琦等[36]的研究证实EGB761能进一步改善患者的残留头晕症状，其增加红细胞变形能力，抑制血小板凝集、提高血管壁弹性，从而改善前庭的微循环障碍、减轻内耳代谢失常和椭圆囊的损伤、促进耳石在内淋巴液中的吸收，起到对前庭神经细胞保护作用。Lindner等[37]发现健康SD大鼠单侧迷路切除术(unilateral labyrinthectomy，UL)后会导致前庭失衡，出现自发性眼球震颤、姿势不对称、眩晕等特征性体征，EGB761治疗可能是通过调节前庭-眼球运动、前庭-脊髓等神经网络系统，提高运动行为和活动能力来改善前庭功能，从而促进UL后大鼠眼球震颤和姿势不对称的代偿。目前对于银杏叶提取物改善前庭功能、促进前庭代偿的机制研究多局限于血液流变学和功能学方面，今后需要从电生理和分子生物学的角度深入研究银杏叶提取物对于前庭器官和前庭细胞的保护作用。

综上所述，银杏叶提取物针对内耳疾病的防护是通过消除自由基、维持线粒体膜稳定性、改善血液流变学、抑制炎症因子释放、抗细胞凋亡、减轻谷氨酸细胞毒性等多种机制共同发挥作用，由于内耳疾病的发病机制复杂，最新研究发现miRNA及相关信号通路调控的细胞自噬也参与到了多种内耳疾病的发生、发展过程中，因此，还需要更多的临床研究和基础实验来全方位、多层次、多角度探讨银杏叶提取物保护内耳的机制，为临床上使用银杏叶提取物治疗内耳疾病提供更多的参考依据。