BRAFV600E突变蛋白及β-catenin、cyclin D1在cN0期甲状腺微小乳头状癌中的表达及意义

宋创业，孟艳林，刘冰，刘攀云，李伟，严丽，李晓武，苗建军，尚培中

（中国人民解放军陆军第八十一集团军医院 1.普通外科 2.疾病预防控制科 3.内分泌科 4.病理科，河北 张家口 075000；5.河北医科大学第二医院 腺体外科，河北 石家庄 050000）

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，发病率逐年递增[1]。在临床常见的4 种组织病理学分型中，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最为多发，约占全部TC 的60%～70%[2]。绝大多数PTC 进展缓慢、恶性度低、预后良好，但有少数患者仍可并发淋巴结或远处脏器转移，是造成患者术后复发、生存质量下降的重要原因[3-5]，此类患者放射性碘治疗无效，预后较差[6]。临床上把肿瘤直径≤1 cm 的PTC 定义为甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）[7-8]，虽生长缓慢，但常伴有颈部淋巴结转移[9]，对于术前查体及影像学检查未发现颈淋巴结转移（cN0）的PTMC 患者，常规行预防性中央区淋巴结清扫，可以清除潜在的转移淋巴结，手术更加彻底并能降低再手术的发生率，但同时可导致神经损伤、乳糜漏、甲状旁腺功能减退等手术并发症的增加。有学者[10-11]认为，BRAFV600E突变及Wnt/β-catenin 信号通路中相关蛋白表达异常，可能与PTMC 发生发展、颈部淋巴结转移有关。本研究为进一步探讨cN0 期PTMC 中BRAFV600E突变及β-catenin、cyclin D1 蛋白表达情况与PTMC 的发生发展及中央区淋巴结转移的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018 年3 月—2021 年9 月收治经手术治疗的cN0 期PTMC 患者120 例，留取癌灶组织、癌旁组织及淋巴结标本，癌旁组织取自距癌灶边缘2 cm 以上的正常甲状腺组织，淋巴结为中央区（Ⅵ区）组织。其中男31 例，女89 例；年龄23～76 岁，平均年龄（53.5±12.7）岁，病变位于甲状腺左叶36 例，右叶69 例，双叶均有病变15 例。手术方式：甲状腺全切+双侧中央区淋巴结清扫术15 例，甲状腺全切+患侧中央区淋巴结清扫术37 例，甲状腺腺叶、峡部切除+患侧中央区淋巴结清扫术68 例。纳入标准：⑴ 首次就诊；⑵ 术前查体、B 超、CT 等影像学检查未发现淋巴结转移（cN0 期）；⑶ 行甲状腺切除术及pCLND；⑷ 切除甲状腺组织经病理证实为PTMC；⑸ 手术前后相关实验室检查结果无缺失。排除标准：⑴ 非原发病变；⑵ 既往有PTMC 手术治疗史；⑶ 合并其他恶性肿瘤；⑷ 伴有血液、免疫系统缺陷性疾病；⑸ 急慢性感染或近期应用免疫抑制剂等相关治疗药物。

1.2 试剂与设备

Ventana 全自动免疫组化染色仪（美国Ventana公司）；兔单克隆阴性质控抗体、鼠单克隆抗体试剂、OptiView IHC 检测试剂盒及扩增试剂盒（美国Roche 公司）；兔抗人β-catenin、cyclin D1 多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）；BenchMarkXT 全自动切片染色机（美国Ventana 公司）。

1.3 方法

1.3.1 BRAFV600E蛋白检测 采用Ventana 全自动免疫组化染色仪对标本进行免疫组化染色，检测BRAFV600E蛋白的表达情况。取组织样本用4%中性甲醛固定，常规取材、脱水、石蜡包埋，进行4 μm 切片。依据Ventana 全自动染色说明书进行实验操作，苏木精染色5 min 后，显微镜下观察染色。结果判定：BRAFV600E阳性定位于细胞质，100 倍镜下随机计数5 个视野，根据细胞着色强度及阳性细胞占整张切片同类型细胞的百分比进行分级。分别采用双盲评分法及阳性细胞所占同型细胞的百分比进行评分。细胞着色强度评分标准：0 分：无着色；1 分：淡黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色。阳性细胞所占百分比评分标准：1 分：阳性细胞≤10%；2 分：阳性细胞占11%～49%；3 分：阳性细胞占50%～79%；4 分：阳性细胞占比≥80%。结果判定标准：将两种评分相乘进行总体评分：0～4 分为低表达，定义为阴性；5～12 分为高表达，定义为阳性。

1.3.2 β-catenin、cyclin D1 蛋白检测 取液氮冻存的PTMC 组织和癌旁组织放入预冷4%多聚甲醛固定24 h、制成石蜡切片，10%山羊血清室温封闭1 h，分别滴加β-catenin、cyclin D1 抗体4 ℃孵育过夜，次日蒸馏水漂洗3 次，滴加二抗复合物室温孵育1 h，二氨基联苯胺显色，苏木精复染或不复染，脱水、透明、封片，显微镜观察并摄片。结果判定：β-catenin 主要定位于细胞质，而cyclin D1 定位于细胞核。染色阳性是指细胞核淡黄色至棕褐色着色，仅胞质染色视为阴性。综合判断高倍镜下阳性细胞百分率和染色强度评分。按染色强度评分：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。按阳性细胞百分率评分：高倍镜下随机选取5 个视野取阳性细胞数之平均数为该例阳性细胞数结果，阳性细胞数≤5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，>75%为4 分。两项得分结果相乘：0～4 分为低表达，定义为阴性；5～12 分为高表达，定义为阳性。

1.4 统计学处理

采用IBM SPSS 23.0 软件包进行统计分析，计数资料以例数表示，数据资料采用χ2检验分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组样本中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表达情况

检测结果显示：BRAFV600E蛋白定位于PTMC细胞质，在PTMC 组织中呈阳性表达，在癌旁组织中呈阴性表达；β-catenin 蛋白主要表达于PTMC细胞质中，部分癌旁组织细胞核内也可见表达；cyclin D1 蛋白主要表达于PTMC 细胞核内，在癌旁组织中呈阴性表达（图1）。

图1 免疫组化检测（×100）Figure 1 Immunohistochemical staining (×100)

2.2 两组样本中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表达比较

在PTMC 组织中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白呈高表达，阳性表达率分别为70%、35.8%、57.5%，在癌旁组织中的阳性表达率分别为31.7%、20.8%、34.2%，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 PTMC和癌旁组织中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表达比较Table 1 Comparison of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expression in PTMC and paracancer tissues

2.3 BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表达与PTMC临床病理特征的关系

PTMC 组织中，BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白阳性表达与性别、年龄无关（均P>0.05）；cyclin D1 蛋白阳性表达与肿瘤直径有关，BRAFV600E蛋白阳性表达与病灶数目有关，差异有统计学意义（均P<0.05）；而BRAFV600E、β-catenin 蛋白表达阳性率与肿瘤直径无关（均P>0.05）；β-catenin、cyclin D1 蛋白表达阳性率与病灶数目无关（均P>0.05）；BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白阳性表达均与颈部中央区淋巴结转移有关（均P<0.05）（表2）。

表2 BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表达与PTMC临床病理特征的关系［n（%）］Table 2 Relations of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expressions with the clinicopathologic feature of PTMC [n(%)]

3 讨 论

TC 是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占所有内分泌肿瘤的95%，占全身实体恶性肿瘤的1%[12]。PTC 是临床常见的TC 病理分型，生长缓慢，多见于年轻女性，预后良好，被称为“良性癌症”[13-14]。临床上把肿瘤直径≤1 cm 的PTC 称为PTMC，在我国每年新发PTC 中约30%～40%的患者为PTMC，部分PTMC 病变可呈现出高侵袭性生物学行为，而并非单纯的PTC 早期病变，且常伴有中央区淋巴结转移（central lymph node metastasis，CLNM），CLNM 发生率可高达30%以上[15-16]。有学者[17-20]认为，PTMC 的发生、发展及转移可能与BRAFV600E基因突变、Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达异常有关。

BRAF 基因，即鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1），位于人类7 号染色体上，编码RAF 家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调节丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（motigen-activated proteinkinase/extracelluar regulated protein kinase，MAPK/ERK）信号通路，影响细胞的分裂和分化，是人类最重要的原癌基因之一[21-22]。BRAFT1799A点突变是最常见的BRAF 基因突变类型，是指第15 位外显子第1 799 位脱氧核苷酸上的胸腺嘧啶（T）被替换为鸟嘌呤（A），导致蛋白质第600 位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）所代替，即BRAFV600E突变，BRAFV600E突变可诱导肿瘤细胞的无限增殖和分化[23]。有研究[24]表明，PTC 病变组织中BRAFV600E突变率保持在较高水平，且有明显的增长趋势。另有学者[25-26]认为，BRAF 基因是PTC 特异度较高的分子标志物。本研究检测结果显示，BRAFV600E突变蛋白在PTMC 组病变组织中阳性率高达70.0%，而在癌旁组织中阳性率为31.8%（P<0.05）；亦证实BRAFV600E突变在cN0 期PTMC 发生、进展及中央区淋巴结转移过程中起重要作用（P<0.05）。

临床上对Wnt/β-catenin 信号通路研究较多且较深入，Wnt/β-catenin 信号通路也叫经典Wnt 信号途径，具体过程是：当经典的Wnt 信号通路被激活后，分泌到细胞外的Wnt 与跨膜受体LRP5/6 以及Fzd 结合形成复合物并激活受体，进而激活胞内的Dishevelled 蛋白（Dsh），导致糖原合成酶3（glycogensynthasekinase-3，GSK-3，GSK-3）活性受到抑制使其从axin 上脱落，阻止β-catenin 降解复合体（主要由APC、axin、GSK-3 构成）的形成，故β-catenin 也不会被磷酸化和降解，使胞内β-catenin表达升高。当胞内β-catenin 达到一定水平时，游离β-catenin 发生核转移，与转录因子TCF/LEF 结合，形成转录激活复合体，最终实现某些 特定基因（如C-myc、cyclin D1、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生长因子等）表达的增强或减弱。Wnt/β-catenin 信号通路在肿瘤发生、发展及转移的过程中起着重要作用，亦是细胞生长增殖调控的关键途径[27-28]。cyclin D1 是Wnt 信号转导通路中重要的靶基因，在多种肿瘤中cyclin D1 过表达，β-catenin的异常表达均和Wnt 突变有密切联系。有研究[29-31]证实，Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活在多种肿瘤的发生、发展、转移过程中起重要作用，且恶性肿瘤组织中β-catenin、cyclin D1 蛋白阳性表达均显著高于癌旁组织，其表达程度与淋巴结转移密切相关。本研究结果显示，在PTMC 组织中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白呈高表达，阳性率均高于癌旁组织，分别为70%、35.8%、57.5%，组间对比具有统计学差异（P<0.05），且β-catenin、cyclin D1 蛋白表达阳性与颈部中央区淋巴结转移密切相关，差异有统计学意义（P<0.05），故二者可能促进了PTMC 患者发生发展及中央区淋巴结转移，提示β-catenin、cyclin D1 蛋白异常表达，可作为cN0 期PTMC 可靠标志物。

本研究纳入的120 例PTMC 患者病理资料中，BRAFV600E表达阳性率70.0% 与汪杰等[32]报道的29%～83%基本一致。Zheng 等[33]研究发现，PTMC原发病灶和转移的淋巴结中常检测出BRAFV600E突变。姬巍等[34]研究结果显示，BRAFV600E突变型PTMC 的组织侵袭力强，容易侵犯甲状腺周围组织，临床病理分期高；肿瘤多灶、中央区淋巴结转移的PTMC 患者，BRAFV600E突变率更高。本研究中cyclin D1 蛋白阳性表达率为57.5%，肿瘤直径≥5 mm、中央区淋巴结转移的PTMC 与cyclin D1 表达明显相关（P<0.05）。BRAFV600E基因突变者PTMC 组织中cyclin D1 呈高表达，cyclin D1表达上调与BRAFV600E基因突变呈正相关，可作为PTMC 临床病理诊断的重要辅助指标，亦可作为评估PTMC 侵袭能力、淋巴结转移、手术方式、术后放射性碘治疗及内分泌治疗的重要参数。

综上所述，cN0 期PTMC 组织中BRAFV600E突变及β -catenin、cyclin D1 蛋白表达明显增强；BRAFV600E突变及β-catenin、cyclin D1 蛋白高表达促进了PTMC 的发生发展及中央区淋巴结转移。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。