黄芩素在伊立替康抑制结肠癌细胞增殖中的作用研究

孟祥彩，刘 洋，武 玉，刘振方，王益民

(1.秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛 066000；2.石家庄市中医院，河北 石家庄 050051)

有统计学数据显示，结肠癌是仅次于肺癌、肝癌的全球第三大常见恶性肿瘤[1]。国际癌症研究机构数据显示，2020年全球结直肠癌男性、女性发病率分别为第3位、第2位，而死亡人数均居癌症第3位[1-2]。我国结直肠癌的新发病人数仅次于肺癌，已成为第二大恶性肿瘤[3]。由于结肠癌患者早期症状一般不明显，因而结肠癌患者一经诊断往往为中晚期[4]。虽然，传统治疗方式和新兴治疗方法在一定程度上延长了患者生存周期，但多数患者最终仍死于结肠癌及其并发症。因此，临床治疗结肠癌的有效手段有待进一步开发与应用。

中医理论认为，结肠癌属于“肠风脏毒”“下痢”，多数由人体正气虚弱，无力抗邪，淤、气、毒，留滞结肠，日久形成“肠风脏毒”[5]。中药黄芩性寒，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，对肠癌等多种肿瘤具有一定疗效。黄芩素是从黄芩中提取的黄酮类化合物，已被证实是黄芩抗肿瘤功效的重要化合物[6-7]。黄芩素能抑制多种肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡[8]。在结肠癌相关研究中，黄芩素可抑制细胞增殖、克隆形成及细胞迁移等恶性生物学行为[9]。近年研究发现，黄芩素在恶性肿瘤放化疗增敏中发挥一定作用，但黄芩素对结肠癌化疗敏感性的影响及相关机制还不完全清楚[10-11]。本研究以结肠癌HT-29细胞作为研究对象，观察黄芩素预处理在伊立替康抑制结肠癌细胞增殖中的作用，并对相关信号机制进行探讨，为临床治疗结肠癌提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞和药品：人结肠癌HT-29细胞(南京科佰生物科技有限公司)；黄芩素(纯度98%，Sigma Aldrich公司)。

1.1.2 实验试剂：MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(批号20201225，北京索莱宝公司)；RPMI1640培养基(批号C11875500CP)、胎牛血清(批号2132094P)、胰蛋白酶(批号2152875)均为美国Gibco公司制品；PVDF膜(美国Millipore公司)；Src抗体(批号6)、p-Src抗体(批号3)、Yes相关蛋白(Yes-related protein，YAP)抗体(批号26)、p-YAP抗体(批号16)、大肿瘤抑制因子激酶1(Large tumor suppressor kinase 1，LATS1)抗体(批号9)、p-LATS1抗体(批号18)、GAPDH抗体(批号5)、羊抗兔IgG-HRP抗体(批号28)均为美国Cell Signaling Technology公司制品。

1.1.3 实验仪器：spectraMaxM5酶标仪(美国Molecular Devices公司)；CKX53倒置显微镜和IXPLORE Live倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；GelDocXR凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：HT-29细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测HT-29细胞增殖能力：HT-29细胞培养至70%～90%汇合度时进行铺板。收集细胞并将细胞重悬至40000个/ml。96孔板每孔加入200 μl细胞悬液，置于培养箱培养过夜。次日，以50、100、200 μmol/L黄芩素预处理细胞12 h后，以梯度浓度伊立替康(0.5、1、5、10、50 μmol/L)处理细胞24 h。向细胞中加入20 μl MTT(5 mg/ml)置于培养箱孵育4 h。吸出培养液，加入200 μl二甲基亚砜轻微震荡，在spectraMaxM5酶标仪中检测吸光度值。

1.2.3 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力：将HT-29细胞培养至70%～90%汇合度，收集细胞并将部分细胞以全培养基稀释至200个/ml。吸取3 ml细胞悬液至6孔板中培养过夜。次日，以50、100、200 μmol/L黄芩素预处理细胞12 h后，以5 μmol/L伊立替康处理细胞24 h。更换新的全培养基继续培养7 d，依次以4%多聚甲醛和0.1%结晶紫染色对细胞进行固定和染色。拍照记录每个处理组细胞克隆情况。

1.2.4 Western blotting法检测p-Src、p-YAP和p-LATS1蛋白表达水平：细胞以50、100、200 μmol/L黄芩素处理24 h后以RIPA裂解液裂解细胞以提取总蛋白。各处理组总蛋白以BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据定量浓度制备电泳蛋白样品，蛋白浓度为30 μg或10 μl。采用10% SDS-PAGE电泳将总蛋白分离，并采用转膜技术将分离蛋白转印至PVDF膜上，PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭后孵育p-Src(1∶1000)、Src(1∶2000)、YAP(1∶1000)、p-YAP(1∶500)、p-LATS1(1∶500)、LATS1(1∶2000)及GAPDH(1∶1000)过夜；次日，洗去各一抗后以羊抗兔IgG-HRP抗体孵育1 h，洗去二抗后以ECL化学发光液在凝胶成像仪下进行成像。

1.2.5 免疫荧光实验检测YAP蛋白表达分布:将细胞接种于置有盖玻片的6孔板中培养过夜；次日，以200 μmol/L黄芩素组处理细胞24 h，以4%多聚甲醛、Triton X-100及5%牛血清白蛋白分别处理细胞2个10 min及2 h，而后孵育YAP抗体(1∶600)过夜；次日，洗去一抗后滴加荧光二抗(1∶250)避光孵育1 h，洗去二抗并用含DAPI的抗荧光猝灭液封片，于荧光显微镜下成像拍照。

2 结 果

2.1 各组对伊立替康抑制结肠癌细胞增殖作用比较 MTT结果显示(图1)，50 μmol/L黄芩素组、100 μmol/L黄芩素组、200 μmol/L黄芩素组均能增加伊立替康对HT-29细胞的增殖抑制作用(P<0.05)，并存在剂量依赖性。

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01

2.2 各组对伊立替康抑制结肠癌细胞克隆作用比较 平板克隆实验显示(图2)，对照组、50 μmol/L黄芩素组、100 μmol/L黄芩素组、200 μmol/L黄芩素组的克隆形成率分别为100%、(67.6±6.5)%、(39.2±5.1)%、(12.3±3.1)%。与对照组相比，50 μmol/L黄芩素组、100 μmol/L黄芩素组、200 μmol/L黄芩素组的HT-29细胞克隆形成率均低，差异有统计学意义(P<0.01)，且与黄芩素浓度成反比。

图2 各组对伊立替康抑制HT-29细胞克隆作用

2.3 各组HT-29细胞p-Src蛋白表达比较 见表1(图3)。与对照组相比，50 μmol/L黄芩素组、100 μmol/L黄芩素组、200 μmol/L黄芩素组p-Src蛋白表达均下调，差异有统计学意义(P<0.01)，且呈剂量依赖性。

表1 各组HT-29细胞p-Src蛋白表达比较(%)

图3 各组HT-29细胞p-Src蛋白电泳图

2.4 各组HT-29细胞p-YAP、p-LATS1蛋白表达比较 见表2(图4)。与对照组比较，50 μmol/L黄芩素组、100 μmol/L黄芩素组、200 μmol/L黄芩素组p-YAP和p-LATS1蛋白表达均上调，差异有统计学意义(P<0.01)，且呈剂量依赖性。

表2 各组HT-29细胞p-YAP和p-LATS1蛋白表达比较(%)

图4 各组HT-29细胞p-YAP和p-LATS1蛋白电泳图

2.5 各组细胞质YAP蛋白表达比较 对照组细胞YAP蛋白以细胞核表达为主，而200 μmol/L黄芩素组细胞YAP蛋白在细胞核和细胞质内均可见明显表达，见图5。

图5 各组HT-29细胞YAP蛋白表达(免疫荧光染色，×100)

3 讨 论

中草药治疗是中医内治的主要方法，是我国传统治疗的重要手段。随着现代医学体系的引入，中草药的治疗机制并不能以明确的西医治疗机制完全解释。近年来对中草药复合成分进行提取、分离和鉴定，以及相关机制研究，在一定程度上解释了中医药治疗的潜在药理机制。一些中草药提取物如青蒿素[12]、紫杉醇[13]、秋水仙素[14]等单体化合物，具有明确的作用机制和较好的治疗效果，已在临床上广泛应用。

黄芩素是从中药黄芩中提取的黄酮类化合物[5]。研究显示，黄芩素能诱导结肠癌SW480细胞凋亡，而该作用可能与Caspase-3依赖性通路有关[15]。还有研究显示，黄芩素及其代谢产物黄芩苷可以诱导结肠癌细胞HCT116和SW480细胞周期阻滞，并抑制克隆形成和迁移，上述作用是通过抑制MAPK/ERK和p38信号通路完成的[9]。还有研究显示，黄芩素可下调HT-29细胞STAT3、NF-κB蛋白表达，并上调P53蛋白表达，进而抑制细胞增殖和迁移[16]，提示黄芩素在结肠癌中可能通过多种途径抑制细胞的恶性生物学行为。在本研究中，黄芩素可增强伊立替康对结肠癌HT-29细胞的增殖、克隆，形成抑制作用，提示黄芩素能增强HT-29细胞对伊立替康的敏感性。

Src是一种非受体蛋白络氨酸激酶，在细胞运动、增殖及存活中发挥关键作用。Src激酶在包括结肠癌在内的多种恶性肿瘤发生发展过程中发挥积极作用。Src能通过ANXA2/STAT3 信号通路诱导结肠癌上皮间质转化[17-18]。本研究发现，黄芩素诱导Src激酶磷酸化，发挥增强伊立替康对HT-29细胞的增殖抑制作用。最近的研究显示，Src 激酶参与调节 YAP 的去磷酸化而调控细胞增殖[19]。一项对肠上皮细胞的研究表明，gp130 通过 Src 诱导 YAP 核转位，从而诱导肠上皮细胞增殖[20]。在本研究中黄芩素通过Src调节结肠癌细胞对伊立替康增敏可能与YAP有关。进一步研究发现，黄芩素能明显诱导LATS1、YAP磷酸化，并增加YAP的细胞质分布，提示黄芩素可能通过抑制Src磷酸化而诱导LATS1/YAP磷酸化级联反应，减少YAP进入细胞核调节转录，抑制细胞增殖。