息痛散通过富含半胱氨酸蛋白61对痛风性关节炎大鼠炎症反应的干预机制

南晓强，杨浩峰，雷 鹏

(1.陕西省人民医院中医科，陕西 西安 710068；2.渭南市中心医院，陕西 渭南 714000)

痛风性关节炎(Gouty arthritis，GA)是由关节内尿酸钠(Monosodium urate crystals，MSU)结晶异常，沉积引起的复发性慢性炎症性疾病，为痛风最常见的首发症状之一，是男性和绝经后妇女最常见的炎症性关节炎[1]。摄入过多富含嘌呤的食物是GA重要的致病因素，近年来随着人们饮食习惯的改变，GA发病率逐年上升[2]。

急性痛风性关节炎发作虽然以自限性炎症为特征，但发作时疼痛难忍，甚至可导致关节残疾，高尿酸血症被认为是本病最重要的独立危险因素[2]。MSU长期沉积于滑膜或滑膜腔中可导致不可逆的关节损伤，伴有骨侵蚀及痛风结节形成[3]。研究发现关节内MSU晶体的存在并不一定会导致炎症发作，但人体中性粒细胞、单核巨噬细胞、滑膜细胞、T淋巴细胞等均可与MSU晶体发生相关反应，释放多种细胞因子，促使急性痛风性关节炎发作[4-5]。富半胱氨酸蛋白61(Cysteine-rich protein 61，Cyr61)是重要的促炎因子，参与炎症微环境和自身免疫性疾病的调节[6-7]。正常情况下，Cyr61表达量较低，以维持机体生理需要，当外界刺激(如炎症刺激、机械张力刺激等)时，其表达增加，进一步加重炎症反应[8-9]。近期研究表明，Cyr61蛋白的高表达可以诱导痛风性关节炎大鼠滑膜细胞产生大量炎症因子[10]。

息痛散是本课题组经临床实践应用多年的效验方，该方由生石膏、忍冬藤、苍术、黄柏、牛膝、桃仁、全蝎组成。前期实验证明该方可减轻痛风性关节炎模型大鼠足跖肿胀度，改善大鼠关节周围组织炎症反应，降低Caspase-1、TNF-α、NF-κB等炎症指标表达[11-12]，但其作用机制有待进一步研究。鉴于此，本研究通过制备尿酸钠晶体诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型，观察息痛散是否通过调节Cyr61表达水平，抑制炎症因子，减轻炎症反应。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：雄性SD大鼠50只，平均体重(250±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供。各组大鼠均置于洁净动物房,室内持续12 h光照后再持续12 h避光处理，饲养期间按此循环给光；动物房室温维持在22 ℃、湿度40%，自由摄水、进食，适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2 实验药物与试剂：尿酸钠(批号U2875-5G)、秋水仙碱(批号H20113208)、Cyr61-shRNA慢病毒(上海吉凯基因公司)。

1.1.3 实验仪器：全自动研磨仪(型号F-MM400，湖南弗卡斯实验仪器有限公司)、台式高速冷冻离心机(型号Sorvall Legend Micro 17，赛默飞世尔科技有限公司)、垂直电泳槽(型号165-8001，美国伯乐公司)、荧光定量PCR仪(型号LightCycler 480，美国罗氏公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备：采用Coderre和Wall改进的方法建立急性痛风性关节炎大鼠模型[13]。用1%戊巴比妥钠皮下注射麻醉大鼠，将注射器从右踝关节外侧与胫骨呈30°～45°方向插入踝关节腔内，注射尿酸钠混悬液0.2 ml(2.5 g/100 ml)。如关节明显肿胀，表明造模成功。正常组大鼠给予右踝关节注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 实验分组：将50只SD大鼠随机分为正常组、模型组、息痛散组、息痛散联合shRNA组、秋水仙碱组，每组各10只。根据人与动物体表面积换算，秋水仙碱组用药剂量为3×10-4g/(kg·d)，息痛散组为72 g/(kg·d)；正常组、模型组给予等剂量0.9%氯化钠溶液，息痛散联合shRNA组造模成功后立即将Cyr61-shRNA干扰慢病毒0.2 ml注射入关节腔，滴度为1E+7TU/ml。秋水仙碱组造模前剂量为1×10-4g/kg，造模后为3×10-4g/kg。其余各组灌胃给药方法同前，连续给药7 d。

1.2.3 指标检测：关节肿胀指数的评估,在实验前用记号笔在大鼠右踝关节处做标记。使用数字卡尺测量大鼠右踝关节周长，最小精度为0.01 mm。关节肿胀指数=(造模后-造模前)周长/造模前周长。每组重复3次，取平均值。血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平使用真空采血管采集大鼠腹主动脉血约5 ml，标号，放置2 h后用低温高速离心机在4 ℃条件下3000 r/min离心15 min，取上清液进行分装，置于-80 ℃冰箱保存备用。采用ELISA法测定大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平，严格按照试剂盒说明书所提供的方法及步骤操作，检测前将所用试剂和样本恢复至室温。Western blotting检测Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白含量,取等量的大鼠右侧踝关节滑膜组织，每管组织加入400 μl裂解液，同时加入PMSF，取上清液进行蛋白质定量。随后进行电泳、转膜、封闭，使用一抗稀释液将一抗稀释成适宜浓度[Cyr61(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、TNF-α(1∶1000)、IL-6(1∶1000)]；4 ℃反应过夜；次日，用1×TBST洗膜3次；使用二抗稀释液将HRP标记山羊抗兔抗体稀释到1∶5000，室温孵育膜60 min；再次用1×TBST洗膜3次，每次10 min；将膜浸入ECL发光液中，反应1 min；根据不同的发光强度调整使用Tanon-5200成像系统检测目标靶蛋白；最后用Image J软件分析蛋白条带灰度值。应用实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA含量,取大鼠右侧踝关节滑膜组织，组织样品用Trizol提取总RNA，并进行RNA定量，用All-in-One第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，用荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析,引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠右踝关节肿胀指数比较 见表2。模型组、息痛散组、秋水仙碱组在造模各时间点的肿胀指数均高于正常组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05),提示各造模组大鼠右踝关节明显肿胀，造模成功。息痛散组和秋水仙碱组踝关节肿胀指数均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；息痛散联合shRNA组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠右踝关节指数比较

2.2 各组大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平比较 见表3。各组大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。息痛散组和秋水仙碱组大鼠血清中Cyr61、IL-1β、IL-6、TNF-α均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。息痛散联合shRNA组与模型组血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6比较[pb/(n·L)]

2.3 各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达比较 见表4(图1)。干预后，模型组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达均高于正常组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达，差异有统计学意义(均P<0.05)。息痛散组和秋水仙碱组Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达均低于模型组Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达，差异有统计学意义(均P<0.05)。息痛散联合shRNA组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表4 各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达比较

图1 各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白电泳图

2.4 各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比较 见表5。大鼠建模成功后，各组大鼠给予对应的药物处理，观察各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA情况。模型组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达均高于正常组，差异有统计学意义(均P<0.05)。息痛散组和秋水仙碱组Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6 的mRNA均低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。息痛散联合shRNA组各项的mRNA与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 各组大鼠踝关节滑膜组织中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比较

3 讨 论

中医学中并没有痛风性关节炎的病名，根据其临床表现，可归属为“痹症”“历节”范畴[14]，《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，将痹症分为风痹、痛痹、着痹。汉代张仲景《金匮要略》中有血痹、湿痹、历节之名，并且创制了乌头汤、桂枝芍药知母汤。痛风最早见于南朝梁时著名医家陶弘景的《名医别录·上品》，主要阐明痛风是由风邪侵袭而致。元代朱丹溪又对痛风的临床表现和发病机制进行具体论述，提出了多种诊疗方法，《格致余论·痛风论》提出：“作痛，夜则痛甚”“治法以辛热之剂”；《丹溪心法·痛风附肢节痛》记载：“四肢百节走痛是也”。通过以上文献的整理，笔者认为其发病机制主要与嗜食肥甘，饮酒无度，日久伤及脾胃，脾失运化，湿热痰浊蕴积于体内，久则衍化毒热有关，湿、热、毒邪相互搏结，随经外达筋骨关节，引发关节红、肿、热、痛等症。因此，痰热、湿毒壅盛为本病病机之所在，治疗以祛风除湿，清热泻火，通络止痛为原则。息痛散中生石膏辛甘性寒，质重降火；忍冬藤清热解毒，宣泄风热，活血通络，两者共为君药；苍术、黄柏以二妙组成，既可增强生石膏、忍冬藤清热解毒之力，又可燥湿化痰；全蝎、桃仁活血通络以止痛，为臣药；牛膝活血通络，引药下行，使药直达病所，全方共奏祛风除湿，清热泻火，通络止痛之功。前期研究发现，息痛散可以减轻急性痛风性关节炎大鼠关节腔内尿酸盐结晶沉积，改善急性痛风性关节炎大鼠足跖肿胀度，但炎症因子的调控机制尚不清楚[11]。

GA炎症的发生与IL-1β、TNF-α、IL-6密切相关。中性粒细胞异常聚集是风湿性疾病的标志。有研究表明，中性粒细胞减少可抑制关节炎症，因此减少中性粒细胞的募集或者激活可能有助于痛风性关节炎治疗[15]。在急性痛风发作期间，中性粒细胞是关节腔渗出液中的主要细胞群[16-17]，当其与尿酸钠晶体接触时，并产生和释放活性形式的IL-1β[18]，导致网状沉淀的形成[19]。并通过释放TNF-α、IL-6和前列腺素E进一步激活局部炎症反应，介导患者痛觉加重[20-22]。在本研究中发现痛风模型大鼠滑膜组织和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6均升高，与GA炎症反应的特点一致，且息痛散能明显减少GA大鼠模型机体及组织中炎症介质释放。

Cyr61目前被认为是一种新的促炎因子[23]。Cyr61与自身免疫性疾病的发病机制密切相关，其对免疫炎症性疾病的影响越来越受到关注[24-25]。近期研究发现，在类风湿关节炎中，Cyr61在关节炎症、骨破坏的形成过程中均发挥作用[10]。本研究运用Coderre和Wall改进的方法建立急性痛风性关节炎模型，同时使用特异性Cyr61干扰慢病毒注入大鼠病变关节腔，去除滑膜中Cyr61表达，研究结果发现息痛散可减轻急性痛风性关节炎模型大鼠关节足跖肿胀度，当Cyr61表达缺失时，息痛散抑制大鼠关节足跖肿胀度降低，同时IL-1β、TNF-α和IL-6的表达均降低。从本研究结果推测，Cyr61参与了GA的炎症过程，能促进IL-1β、TNF-α、IL-6分泌，是GA炎症过程的重要参与者。息痛散能明显抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA及蛋白表达，当有Cyr61慢病毒干扰时，息痛散抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的能力降低，提示息痛散可能通过下调Cyr61表达来抑制急性痛风性关节炎的炎症反应。

综上所述，息痛散治疗急性痛风性关节炎的分子生物学机制可能与降低Cyr61高表达有关，但炎症反应的上游路线颇多，息痛散如何干预具体靶点将是本课题组下一步的主要研究方向。