通络解毒汤对糖尿病肾病大鼠抗氧化通路的作用机制

魏华娟，赵然然,李世媛,多慧玲,霍浩然

(1.石家庄市中医院，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学第二医院，河北 石家庄050003)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是一种常见的糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因之一，严重危害人类健康。据统计，2019年全球约有4.22亿糖尿病患者，预计到2040年将增至6亿，其中约30%发展为DN[1]。DN 的主要特征性变化包括肾小球基底膜增厚、进行性肾功能不全和持续性蛋白尿，其发生发展与糖脂代谢紊乱、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、高血糖诱导的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)生成等多种因素有关[2-3]。胡雅国等[4]发现，高血糖可促进活性氧的产生并提高大鼠氧化应激水平，加重肾损伤。转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)/血红素氧合酶1(Heme oxygenase-1，HO-1)通路是一条经典的抗氧化通路，与 DN的发展关系密切[5]。目前，现代医学常通过控制血糖与血压、运动、透析等方式抑制DN的发展，但治疗效果欠佳，DN导致终末期肾病的比例仍然很高。

中医有记载DN的文献，可追溯到汉代。经过长期的实践，医者对DN的发展有了更深入的认识，并提出了其发病机制的演变。在中医的反复实践中，以“一阳”理论作为中国古代哲学，阐明了以阴阳平衡为代表的人体健康。中医专家推测，DN的病位在肾，与肝脾功能失调密切相关，本病的性质是本虚标实，湿、血瘀、痰三者并存，使病情迁延难愈。中医药在防治糖尿病并发症方面具有多靶点、不良反应少等优势[6]。本项目于前期研究中观察到，通络解毒汤治疗原生性系膜增生性肾小球肾炎的疗效较好，为进一步观察通络解毒汤对DN的作用机制，本研究通过构建糖尿病肾病大鼠模型，以不同剂量通络解毒汤灌胃，旨在从分子水平阐述该方药对DN的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：清洁级雄性SD大鼠[合格证号SCXX(沪)2013-0016]40只，平均体重(200±20)g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。所有大鼠均饲养于石家庄市中医院实验中心，动物饲养环境为温度22～24 °C，12 h光照/黑暗循环，自由获取标准大鼠食物和水。

1.1.2 实验试剂与仪器：通络解毒汤由石家庄市中医院药剂科统一制备，符合中华人民共和国药典要求。通络解毒汤组成：黄芪20 g，僵蚕、地龙、乌梢蛇各10 g，丹参、红花、金银花、土茯苓各15 g，大黄6 g，常规煎煮浓缩后备用。BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号062521211026，上海碧云天生物技术有限公司)，链脲佐菌素(批号S0130，美国Sigma公司)，SIRT1一抗(批号AB189494，Abcam公司)，HO-1一抗(批号MD4719，北京MDL公司)，Nrf2一抗(批号0072280202，美国Abclonal公司)，血肌酐(Serum creatinine，Scr)试剂盒(批号C011-1-1，南京建成生物工程研究所)，尿氮素(Blood urea nitrogen，BUN)试剂盒(批号C013-2-1，南京建成生物工程研究所)，HE染色套装(批号G1003，中国 Servicebio公司)。全自动酶标仪(型号BIO-Rod450，美国贝尔公司)，高速低温离心机(型号CR22GⅡ，日立公司)，荧光定量Real-time PCR仪(型号CFX，美国Bio-Rad公司)，全自动凝胶成像系统(型号Gel Doc XR+，美国Bio-Rad公司)，荧光成像扫描仪(型号Licor Odyssey，上海Gene公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组、建模及给药：雄性SD大鼠40只，按照随机数字表法分为对照组、模型组、通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组，每组8只。对照组大鼠喂食普通食物(3.51 kcal/g)，其他大鼠喂食高脂食物(4.43 kcal/g)，持续4周。所有大鼠禁食12 h后，于大鼠腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg(用0.1 mol/L的pH 4.3柠檬酸钠溶液稀释至1%)，在30 min内完成注射。同时，对照组大鼠注射相应体积的柠檬酸钠溶液。72 h后，采集大鼠尾静脉血，用 Accu Chek 血糖仪测量血浆葡萄糖浓度，若血糖水平≥16.7 mmol/L，则视为糖尿病大鼠造模成功。4 周后收集所有糖尿病大鼠尿液，若 24 h 尿蛋白>30 mg，则视为DN大鼠造模成功。参考《药理实验方法学》[7]换算人-大鼠的通络解毒汤口服标准剂量为 18.13 g/(kg·d)。在本实验中，通络解毒汤低剂量组每只大鼠的灌胃剂量为18.13 g/(kg·d)；通络解毒汤中剂量组每只大鼠的灌胃剂量为36.26 g/(kg·d)；通络解毒汤高剂量组每只大鼠的灌胃剂量为72.52 g/(kg·d)。灌胃12周后严格记录大鼠体重、饮水量、进食量、空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)。

1.2.2 肾功能和组织学检测：灌胃12周后，采用2.5 ml/kg的2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，下腔静脉取血，收集血清，放入-80℃保存，采用ELISA试剂盒检测BUN、Scr水平，严格按照试剂盒说明书步骤操作。随后，摘除大鼠双肾并记录肾重，将肾组织切片并用4%甲醛固定24 h，按照常规方案脱水并包埋在石蜡中。石蜡包埋后，4 μm 厚的切片在室温下用苏木精染色 3 min，在光学显微镜下用伊红染色 60 s。

1.2.3 Western blotting法检测SIRT1、Nrf2和HO-1的表达：使用核提取试剂盒从肾组织中提取细胞质、核蛋白。Western blotting法检测SIRT1、Nrf2和HO-1的表达。GAPDH用作细胞质蛋白的内部上样对照。Lamin B用作核蛋白的内部上样对照。蛋白质含量由BCA蛋白质测定试剂盒测定。通过在SDS/PAGE上电泳分离蛋白质样品并转移到 PVDF膜上，并用5%脱脂牛奶封闭，并在4 ℃下用适当的一抗(1∶1000稀释抗SIRT1和抗HO-1抗体，1∶500稀释抗Nrf2抗体)孵育过夜，分别用合适的二抗在室温下孵育1 h。通过使用Odyssey荧光成像扫描仪检测免疫复合物，并使用Odyssey软件v3.0.29成像分析系统对条带密度进行定量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett’s法；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠12周后体重、饮水量、进食量比较 见表1。4周后，模型组、通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组大鼠均出现明显的糖尿病特征，包括高血糖、多饮、多食和体重减轻。通络解毒汤灌胃12周后，与模型组大鼠比较，通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组大鼠的体重显著升高，饮水量、进食量降低；通络解毒汤高剂量组饮水量、进食量均低于通络解毒汤低剂量组，且饮水量少于通络解毒汤中剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组大鼠12周后体重、饮水量、进食量比较

2.2 各组大鼠肾组织形态学比较 见图1。对照组大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管排列致密，肾小球毛细血管分界，轮廓完整清晰，黑色箭头所指为肾小球系膜区增生。模型组大鼠肾小管病理改变包括肾小管上皮细胞肿胀、刷状缘缺失、间质扩张、肾小管间出血、空泡变性、肾小管坏死、管型形成等。与模型组比较，通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组大鼠肾小球、肾小管、肾间质结构排列较整齐，肾小球系膜区增生、肾小球体积增大等情况均有改善。

A：对照组；B：模型组；C：通络解毒汤低剂量组；D：通络解毒汤中剂量组；E：通络解毒汤高剂量组

2.3 各组大鼠FBG、Scr、BUN水平比较 见表2。与模型组大鼠比较，通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组大鼠的FBG、Scr、BUN水平均低；通络解毒汤高剂量组大鼠的FBG、Scr、BUN水平均低于通络解毒汤低剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表2 各组大鼠FBG、Scr、BUN水平比较

2.4 各组大鼠SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表达比较 与对照组比较，通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表达均升高(图2)。

A：对照组；B：模型组；C：通络解毒汤低剂量组；D：通络解毒汤中剂量组；E：通络解毒汤高剂量组

3 讨 论

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)与中医“消渴”相同，最早的病因病机记载可追溯到《内经》。《灵枢》记载：“人五脏虚弱，易患消渴。” 先天禀赋不足是导致糖尿病的重要内因。《素问》记载：“常食甘美肥腻之物，易生内热。”甜味易引起腹胀，影响脾胃功能，则湿热上溢。饮食不规律、肠胃内热、阴伤为主要病机，“消渴”根据病位、病机、症状的不同分为多种证型，其中肾阴不足证对应于DN。《圣济总录》记载：“本病的病因是精血不足，肾阴不足。”患者经常渴求饮水，这些水被输送到膀胱，导致大量尿液，其他症状还有小腿肌肉萎缩、关节疼痛，故本病又称“小肾”。DN的中医病机以本虚(脾肾)、虚实(血瘀、水湿、痰浊)为主，病理为痰瘀互结。早期病变为气阴两伤、肝而肾虚，血瘀阻隔，则阴虚引起阳虚，脾肾不足，造成水潴留，溢于皮肤[8]。此阶段水滞聚，因肾阳衰。由于潮湿的毒素会攻击胃和心脏，因此出现严重症状，脾虚是DN的关键病因，肾气亏虚是DN的病根，血瘀参与DN的整个病程。

DM患者常处于高凝状态，长期高凝状态是肾功能受损的重要原因，DM 患者血栓形成的发生率较高。当 DN 出现蛋白尿时，血浆中凝血因子的活性较高，因此DN的发生是因糖尿病病程长，导致脾肾两虚，水湿不能运化，造成上溢，患者常有“瘀血”症状，如高脂血症、高黏血症、微循环障碍等，因此治疗应以健脾补肾、益肾活血化瘀为主[9]。本研究所用的通络解毒汤是临床上长期治疗DN的经验方，由虫类通络药、活血化瘀药、解毒药组成，以清热解毒、祛瘀通络为组方原则。方中僵蚕、地龙、乌梢蛇性喜走窜，入络搜剔；丹参、红花活血通脉，发挥活血化瘀、凉血之功，助僵蚕、地龙、乌梢蛇沟通肾络；金银花清热解毒，断毒邪生成之源；土茯苓清热除湿，大黄通腑祛瘀，二者涤瑕荡秽，泄浊解毒，引起体内积聚之毒分走前后二阴；黄芪益气扶正，既可助通络药逐瘀，畅通肾络，又防止通络解毒药损伤正气，为君药。现代药理学研究表明，黄芪中的两种主要异黄酮、花萼甙、花萼甙-7-O-β-D-葡萄糖苷，可抑制HG诱导的系膜细胞早期增殖和AGEs介导的细胞凋亡，提示这两种异黄酮具有预防DN进展的作用[10-11]。此外，黄芪中的黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅰ，在糖尿病模型中具有抗氧化、抗炎作用，这些化学物质可以预防和恢复与氧化应激相关的肾组织损伤。黄芪甲苷还可降低内质网应激，增加足细胞完整性，是减少蛋白尿的治疗靶点。本研究通过观察各组大鼠肾组织形态发现，与模型组比较，三组给药大鼠肾损伤情况有所改善，通络解毒汤中剂量组和通络解毒汤高剂量组大鼠的FBG、Scr、BUN水平均高于对照组、模型组，说明通络解毒汤在一定程度上能降低血糖，减轻肾损伤，发挥调节血糖，保护肾功能的作用，体现多靶点复合调节特点。

SIRT1是一种去乙酰化酶，可通过去乙酰化活化其下游的PGC-1α、p53等多种蛋白质和转录因子调节葡萄糖代谢、氧化应激、能量稳态过程[12-13]。Nrf2是抗氧化防御系统中的主要调节因子之一，可减少氧化应激、炎症刺激、细胞衰老和细胞凋亡[14]。Nrf2的下游信号分子包括HO-1、醌氧化还原酶1和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基。由位于启动子区域和增强子区域的顺式调节 DNA 序列编码的抗氧化反应元件介导 Nrf2对下游分子的调节[15-16]。细胞损伤后，Nrf2 易位至细胞核并促进 HO-1 的表达[17-19]。SIRT1也可以促进 Nrf2 的激活，增加其核积累、DNA 结合活性和转录活性，以及上调 HO-1 的表达[20-22]。大量研究表明，Nrf2 信号通路在 DN 发展中的重要性，NRF2 激活成为 DN 预防的潜在策略[23-25]。本研究中，通络解毒汤低剂量组、通络解毒汤中剂量组、通络解毒汤高剂量组SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表达均升高，这可能与通络解毒汤上调 SIRT1 表达，激活 Nrf2/HO-1信号通路有关，该方药能增强糖尿病肾病大鼠抗氧化应激损伤能力。

综上，通络解毒汤通过上调SIRT1表达，激活 Nrf2/HO-1信号通路，减轻糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤，保护肾功能。