橡胶树胶乳高表达热激蛋白HbHSP90.4基因抗逆功能分析

陈华峰 代龙军 刘明洋 郭冰冰 杨 洪 王立丰*

（1. 东北林业大学，哈尔滨 150040；2. 农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，农业农村部儋州热带作物科学观测实验站，海南省高性能天然橡胶材料工程重点实验室，中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101）

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是天然胶乳的主要来源，天然橡胶不仅在医疗卫生和交通运输中具有重要作用，而且在国防军工领域是不可或缺的战略资源［1］。天然橡胶不断增长的需求刺激了橡胶种植园在亚马逊地区传统栖息地之外的扩张，现今包括中国在内的60多个国家的热带地区广泛种植橡胶树，特别是在东南亚国家，这些国家生产了全球90%以上的天然橡胶［2］。橡胶树在生长过程中容易遭受低温、干旱和病害等影响，严重时会造成橡胶树胶乳减产和造成经济损失［3-4］。植物在逆境胁迫时，体内蛋白质在压力下可能会错误折叠和聚集，导致细胞会产生许多问题。因此，植物细胞体内都有专门的蛋白质组装来维持蛋白质的稳定［5］。

热激蛋白90（Heat Shock Protein 90，HSP90）是一个广泛存在于原核生物和所有真核生物中的分子伴侣家族，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中Hsp90 家族包括7 个成员：AtHsp90-1 到AtHsp90-4 构成细胞质亚家族，而AtHsp90-5、AtH⁃sp90-6 和AtHsp90-7 分别定位于质体、线粒体和内质网［6］。它们在许多正常的细胞中负责蛋白质折叠、组装、转运和降解，稳定蛋白质和膜，并在应激条件下协助蛋白质重新折叠来维持细胞内稳态，对植物生长发育和保护植物免受胁迫方面发挥关键作用［7］。棉花（Gossypium hirsutum）中HSP90 通过维持细胞内稳态在棉花纤维分化和发育中起着至关重要的作用［8］。植物受到热胁迫时HSP90 保护细胞蛋白免受损伤和使受损蛋白重新折叠，从而使植物变得耐受高温［9］。当NLR 活性水平较高时，HSP90 通过结合SCF 降解来调节NLR 的转归，从而维持NLRs 的稳态水平［10］。拟南芥中HSP90的表达受发育调控，并对非生物胁迫和植物激素敏感［11］。拟南芥AtHsp90.2、AtHsp90.5和AtHsp90.7的过表达增强了植物干旱胁迫的敏感性［12］。此外，HSP90 作为一种特殊的伴侣蛋白结合客户蛋白发挥功能，这些客户蛋白主要参与激酶底物空间结构的形成、初始应激信号转导和维持转录因子空间结构等［13-14］。烟叶（Nicotiana tabacum）中HSP90 与RAR1 和TIR-NB-LRR 相互作用增强了烟叶对花叶病毒的抗性［15］。HSP90 的功能是同源二聚体，每个单体由负责ATP 酶活性的N 端ATP结合域、包含客户蛋白结合位点的中间域和C 端二聚体组成。HSP90 的N 端和C 端结构域能够调控下游蛋白或其他分子伴侣等底物多肽相结合发挥功能。在拟南芥中HSP90的N端ATPase结构域与SGT1 的CS 域 和RAR1 的CHORD Ⅱ域 结 合 参与植物抗病［16］。HSP90的C末端EEVD基序与CCTPR 蛋白TPR 结构域结合在信号转导中起关键作用［17］。HSP90基因在许多植物应对逆境胁迫中的的功能已得到广泛研究，而其在橡胶树中的功能鲜有报道。为解析HSP90基因在橡胶树中的抗逆功能，本研究从胶乳中克隆得到一个橡胶树HbH⁃SP90.4基因，分析其在植物激素、干旱和H2O2等处理中表达模式，并构建植物表达载体，这不仅有利于对橡胶树激素信号通路和胁迫反应机制的了解，还为培育抗逆高产的橡胶树无性系提供候选基因和新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验植物选取健康的橡胶树品种热研73397 10 a 割龄的橡胶树和株高70～80 cm 嫁接苗为材料，种植于中国热带农业科学院试验场和橡胶研究所海南天然橡胶新型种植材料创新基地。

载体和菌株：零背景pTOPO-Blunt平末端载体购自Yeasen Biotech 公司，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感 受 态 购 自 庄 盟 生 物 公 司、农 杆 菌GV3101 菌株购自购自唯地生物公司，植物表达载体mScarlet 由农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理

选取橡胶树品种热研73397 的根、花、枝、茎、叶和胶乳作为HbHSP90.4基因克隆和不同组织的表达量分析。不同的激素和胁迫按照以下方法：

（1）低温胁迫试验是将移栽的芽接苗置于4 ℃的培养室中。叶片采集时间点分别为0（对照）、6、12 h。

（2）干旱胁迫按照Wang 的研究方法进行处理［18］，分别在0、1、2、3、4、5、6、7 d 采集叶片，对照组同步采样。

（3）白粉菌侵染根据Qin等的研究方法进行处理［19］，在侵染后0、3、6、12、24、48、72、96 h 采集叶片，对照组同步采样。

（4）植物激素和过氧化氢处理试验：分别将橡胶树嫁接苗喷施200 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、1%（V/V）乙烯利（Ethylene，ETH）、200 μmol·L-1水杨酸（SA）、200 μmol·L-1脱落酸（ABA）、2%（V/V）过氧化氢（H2O2），并以0.05%（V/V）乙醇溶液为对照，分别于喷施后0、0.5、2.0、6.0、10.0、24.0 h采集材料。

以上每个样本包括3个独立的生物学重复，所有采集的样品立即冷冻在液氮中，后在冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成

采集的所有样品参照柯宇航等［20］的方法进行RNA 提取，采用Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析仪检测总RNA浓度和纯度。RNA反转录方法按照TaKaRa 反转录试剂盒实验步骤进行，反转获得的cDNA 保存在-20 ℃冰箱后用于基因克隆和荧光定量分析。

1.2.3 HbHSP90.4生物信息学分析

利用在线工具（见表1）对HbHSP90.4进行生物信息学分析。用于系统进化树的蛋白序列均是HbHSP90.4 蛋白在NCBI 中进行smart Blast 的结果，并使用MEGA X［21］构建系统进化树（neighborjoining，bootstrap 值 设 为1000）以 及 利 用DNA⁃MAN7工具软件进行多序列比对。

表1 生物信息学在线分析工具Table 1 Bioinformatics online analysis tools

1.2.4 HbHSP90.4基因的表达分析

在HbHSP90.4基因序列ORF 区设计qRT-PCR引物（见表2），以反转录的cDNA 为模板，以HbAc⁃tin（GenBank：HQ260674.1）基 因 为 内 参，采 用SYBR Green 法进行qRT-PCR 扩增。通过qRTPCR 技术分析HbHSP90.4基因在不同组织处理、植物激素、干旱、冷胁迫、橡胶树白粉菌侵染和H2O2的表达模式。

表2 HbHSP90.4基因引物Table 2 Primers of HbHSP90.4 gene

1.2.5 HbHSP90.4基因克隆和植物表达载体构建

在橡胶树基因组中获得HbHSP90.4基因序列，利用primer primer6.0 软件设计HbHSP90.4基因引物。以反转录得到的橡胶树热研73397 胶乳cDNA 为模板，按照高保真酶Phanta Max Super-Fi⁃delity DNA Polymerase 试剂盒说明书进行扩增，扩增得到目的片段连接零背景pTOPO-Blunt 平末端载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR检测后挑取阳性克隆菌落保存备用。根据mScar⁃let 植物表达载体图谱设计带有KpnⅠ-BamHⅠ酶切位点插入片段的同源重组引物（见表2），以pTOTO-Blunt-HbHSP90.4质粒为模板扩增片段，以及对表达载体进行双酶切，将扩增目的条带和载体酶切产物按OMEGA 琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒说明书进行回收纯化，获得的胶回收产物通过同源重组体系连接后转化DH5α感受态细胞，在含有Kan 抗性的LB 平板上培养。测序验证后提取质粒电击转化农杆菌GV3101，成功构建HbH⁃SP90.4-mScarlet植物表达载体。

1.2.6 数据统计方法

基因相对表达结果在Excel 2016 软件用2-ΔΔCt法［22］进行分析计算。使用SPSS Statistics 25（IBM）进行单因素ANOVA 检验分析差异显著性，显著水平为α=0.05。采用Origin 2018（Origin Lab Corpo⁃ration）和Power Point 2016软件制图。

2 结果与分析

2.1 HbHSP90.4基因生物信息学

利用DNAMAN7 软件对来源于各种植物的HSP90 相关氨基酸序列进行多序列比对，相似度为90.29%，并标注HbHSP90.4保守结构域（见图1）。为了分析HbHSP90.4 蛋白与其他植物HSP90 的系统进化关系，以HbHSP90.4蛋白smart Blast获得的蛋白序列构建进化树，结果表明橡胶树HbHSP90.4与木薯（Manihot esculenta，XP_021601014.1）的亲缘关系最近，在分类上与麻风树（Jatropha curcas，KDP36908.1）和 蓖 麻（Ricinus communis，XP_002510550.1）聚为一类，这预示着它们的功能可能具有相似性（见图2）。通过Pfam 保守结构域分析结果表明HbHSP90.4 蛋白存在HATPase-Hsp90-like 和HSP90 superfamily 结构域（见图3A），属于HSP90 家族蛋白。PSIPRED Workbench 预测HbH⁃SP90.4 蛋白二级结构富含α螺旋和无规卷曲结构（见图3B）；利用SWISS-MODEL 分析HbHSP90.4的三级结构（见图3C）与其二级结构相符合。采用ExPASy 预测HbHSP90.4 相对分子质量为93 452.91 Da，等电点4.86，总平均亲水性为-0.744，不稳定系数为34.43，推测HbHSP90.4 蛋白是一个稳定的亲水蛋白。TMHMM Server v.2.0 分析预测表明HbHSP90.4 蛋白无跨膜结构（见图4A）。Sig⁃nalP-5.0 Server分析预测HbHSP90.4存在信号肽的概率为99%（见图4B）。DeepLoc1.0 预测分析HbHSP90.4蛋白定位于内质网上（见图4C）。

图1 HbHSP90.4与其他植物HSP90蛋白序列多重对比Fig.1 Multiple protein sequence alignment of HbHSP90.4 with other plant HSP90 proteins

图2 橡胶树HbHSP90.4蛋白与其他物种HSP90蛋白序列的系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HbHSP90.4 protein with other species HSP90 proteins

图3 HbHSP90.4结构分析A.HbHSP90.4保守结构域；B.HbHSP90.4二级结构；C.HbHSP90.4三级结构Fig.3 Structural analysis of HbHSP90.4 A.The conserved domains of HbHSP90.4；B.The secondary structure of HbHSP90.4；C.The tertiary structure of HbHSP90.4

图4 HbHSP90.4定位分析A.HbHSP90.4跨膜结构分析；B.HbHSP90.4信号肽预测分析；C.HbHSP90.4亚细胞定位预测Fig.4 Positioning analysis of HbHSP90.4 A.Structural analysis of HbHSP90.4 transmembrane；B.Prediction analysis of the HbHSP90.4 signal peptide；C.Prediction of HbHSP90.4 subcellu⁃lar localization

2.2 HbHSP90.4基因表达模式

2.2.1 HbHSP90.4基因的组织表达

通过qRT-PCR 分析了HbHSP90.4基因在橡胶树不同组织中的表达模式（见图5）。结果表明HbHSP90.4在橡胶树的根、花、枝、茎、叶和胶乳中均有表达，但表达量在不同组织中差异显著，其中HbHSP90.4在胶乳中的表达量较高，胶乳的表达量是根、花、叶的95 倍左右，推测HbHSP90.4基因主要在胶乳中起作用。

图5 HbHSP90.4基因在橡胶树不同组织中的表达模式不同小写字母表示差异显著水平（P<0.05）；下同Fig.5 Expression patterns of the HbHSP90.4 gene in different tissues of rubber tree The different lowercase letters mean significant difference level（P<0.05）；The same as below

2.2.2 HbHSP90.4 基因在逆境胁迫和H2O2处理下的表达模式

橡胶树生长过程容易遭受各种非生物胁迫和生物胁迫，造成橡胶树胶乳产量的降低。从分子方面研究抗逆基因为培育橡胶树抗逆无性系奠定基础。本研究利用qRT-PCR 分析HbHSP90.4基因在干旱、冷胁迫、橡胶树白粉菌和H2O2处理下的表达模式（见图6）。结果表明干旱胁迫下HbHSP90.4基因显著上调表达，在第6 天时表达量达到最高，是处理前的29 倍。在冷胁迫条件下，HbHSP90.4基因表达量呈现上调趋势。橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片后，HbHSP90.4基因上调的幅度较小。在H2O2处理下，HbHSP90.4基因表达量均显著上调，在6 h表达量达到处理前的8.4倍。以上结果表明橡胶树HbHSP90.4基因响应各种非生物和生物等胁迫。

图6 HbHSP90.4基因在逆境胁迫和H2O2处理下的表达模式A.干旱胁迫；B.冷胁迫；C.橡胶树白粉菌侵染；D.H2O2处理Fig.6 Expression pattern of the HbHSP90.4 gene in response to stress and H2O2 treatment A.Drought stress；B.Cold stress；C.Oidium heveae infection；D.H2O2 treatment

2.2.3 HbHSP90.4 基因在不同植物激素处理的表达模式

植物激素在橡胶树胶乳代谢调控中发挥重要作用，特别是茉莉酸和乙烯利［23］。利用qRT-PCR分析在茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和脱落酸处理下对HbHSP90.4基因的表达影响，结果表明HbH⁃SP90.4基因受茉莉酸甲酯诱导2 h 显著上调表达，其表达量达到23倍（见图7A），而在乙烯利处理下2 h 显著下调表达（见图7B）。水杨酸和脱落酸处理下HbHSP90.4基因分别在6 h 和10 h 显著下调表达（见图7C，D）。以上结果表明HbHSP90.4基因受植物激素影响有正调控和负调控。

图7 HbHSP90.4基因在不同激素处理的表达模式A.MeJA；B.ETH；C.SA；D.ABAFig.7 Expression pattern of HbHSP90.4 gene in different hormone treatments A.MeJA；B.ETH；C.SA；D.ABA

2.3 HbHSP90.4基因克隆与植物表达载体构建

以品种为热研73397 橡胶树胶乳的cDNA 为模板，通过PCR 扩增出与预期大小相符的特异性条带（见图8B）。测序验证后，将cDNA 序列命名为HbHSP90.4。HbHSP90.4基因的cDNA 全长为2 749 bp，包含2 451 bp的开放阅读框（ORF），编码816 个氨基酸。PCR 产物提质粒后与mScarlet 表达载体同时进行双酶切（见图8C），然后进行同源重组连接，菌落PCR 鉴定阳性重组子，检测结果表明目的基因HbHSP90.4已经插入植物表达载体mScarlet 中（见图8D）。通过电击转化法将HbH⁃SP90.4-mScarlet 导入农杆菌GV3101，获得农杆菌工程菌株，可用于后代遗传转化。

图8 HbHSP90.4基因克隆与植物表达载体构建A.mScarlet表达载体构建原理图；B.HbHSP90.4基因克隆；C.mScarlet载体双酶切；D.HbHSP90.4-mScarlet连接阳性PCR检测Fig.8 HbHSP90.4 gene cloning and plant expression vector construction A.Schematic diagram of mScarlet expression vector construction；B.Gene cloning of HbHSP90.4；C.Double digestion of mScarlet vector；D.The posi⁃tive PCR of HbHSP90.4-mScarlet

3 讨论

健康橡胶树能排出几百毫升的胶乳量，排出的胶乳包括橡胶粒子、核糖体、蛋白和核酸等，它们在乳管细胞中及时组装合成与补充是胶乳再生的关键。然而橡胶树的生长总会遭受到环境中的各种威胁，使橡胶树生长受到影响，从而导致橡胶树胶乳减产。在许多研究中我们发现HSP90 是一种高度保守和丰富的蛋白，在维持和调节细胞内蛋白质的构象和功能以及应对逆境胁迫方面起着重要的作用［24］。本研究在橡胶树胶乳中克隆得到HbHSP90.4基因。橡胶树不同组织表达分析显示HbHSP90.4基因主要在胶乳中表达，推测HbHSP90.4基因可能参与胶乳代谢调控过程。HbHSP90.4 蛋白结构分析显示在87～277 aa 存在HATPase-Hsp90-like 结构域，在259～799 aa 存在HSP90 su⁃perfamily 结构域，这2个结构存在是其参与细胞间信号转导和多肽折叠的关键所在。通过亚细胞定位预测结果显示HbHSP90.4基因定位在内质网上，并且HbHSP90.4 氨基酸序列c 端包含KDEL 基序，这与杨树（Populus）PtHsp90-7 蛋白序列c 端KDEL ER 保 留 基 序 定 位 的 结 果［25］一 致，推 测HSP90 保守的细胞器定位预示着它们可能在细胞器特异性发育或应激反应中发挥作用。

温度是影响橡胶树生长的重要环境因子，持续的极端温度都会诱导植物蛋白变性和聚集、质膜完整性的丧失和活性氧（ROS）的积累而扰乱细胞代谢和内稳态［26-27］。本研究结果显示HbH⁃SP90.4基因在冷胁迫处理中上调表达，这与在烟草（Nicotiana tabacum）中的HSP90基因对低温胁迫处理的研究结果［28］一致。这为了解温度变化对橡胶树生产影响和减缓机制提供基础。干旱会影响细胞的原生质膜的组成和叶绿体的超微结构变化，从而推迟橡胶树生抽叶进程，缩短割胶时间，造成橡胶减产［29］。活性氧（ROS）在调控干旱胁迫通路中发挥重要作用。前人研究表明OsHSP50.2基因调节ROS稳态对水稻的抗旱性具有正向调节作用［30］，本研究结果显示HbHSP90.4基因在干旱胁迫和H2O2处理中呈现先上升后下调再上升表达趋势，表明HbHSP90.4基因对干旱胁迫和H2O2处理反应较为敏感。这与在二穗短柄草（Brachypodi⁃um distachyon）中HSP90基因对胁迫响应的研究结果［31］相似。推测HbHSP90.4基因在橡胶树中通过调控H2O2水平应对干旱胁迫。橡胶树白粉菌侵染会引起橡胶树叶片卷曲、萎缩甚至落叶，从而可造成高达45%的胶乳产量损失［32］。前人研究表明通过VIGS 方法沉默HSP90基因后发现Mla 介导的大麦白粉菌抗性减弱［33］。在本研究中接种橡胶树白粉菌后发现，HbHSP90.4基因表达水平稍稍上升，推测HbHSP90.4基因可能参与橡胶树白粉菌抗性过程。

植物激素交叉调控的信号网络是胁迫响应的监视者，参与胁迫修复的任何调节因子的协调，在植物的生长发育过程以及应对各种生物和非生物胁迫发挥着重要作用［34］。JA 和SA 信号通路的相互作用有助于植物应对生物胁迫。在本研究结果显示HbHSP90.4基因受MeJA 诱导上调表达，与HSP90在拟南芥中调控激素信号通路研究结果［35］一致。相反的是，HbHSP90.4基因在ETH、SA 和ABA 植物激素中显著下调表达，推测HbHSP90.4基因激活的植物信号通路可能是相互拮抗调控来触发对各种胁迫的有效防御反应。并且有研究已经证明MeJA 和ETH 处理可以触发橡胶树韧皮组织部的分子机制，包括JA 和ET 信号通路，这些信号通路的相互作用控制着胶乳细胞分化和橡胶生物合成［36］。本研究通过成功构建HbHSP90.4基因的植物表达载体，为下一步遗传转化试验来探究橡胶树HbHSP90.4基因激活植物激素信号通路调控橡胶树逆境胁迫过程和橡胶生物合成奠定坚实基础。