硒处理对斜茎黄芪生长生理和初生代谢的影响

姜婉婷 杨 楠 陈 晨 郭晓瑞 唐中华 王洪政*

（1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

硒（selenium，Se）是人和动物必需的微量元素，而植物体在自然界Se 循环转化等方面具有重要作用，使得近年来植物Se 研究领域也受到普遍关注。研究发现，Se是植物的非必需有益元素，低质量浓度的Se（≤5 mg·L-1）可以促进植物的生长，提高植物在逆境下的光合能力，增加植物中Se 的含量，提高其产量和品质［1］。在Se 的生理浓度范围内，Se 还可以促进植物对土壤中其他矿质元素的吸收［2］，同时，Se还可以拮抗重金属［3］。但是，高浓度的Se 则会对植物产生毒害作用，主要包括叶片萎黄、植物总生物量减少和光合效率降低［4］。目前，Se 胁迫对植物生长生理水平的影响已得到较好的表征，如：李登超等［5］研究发现低质量浓度的Se（≤1.0 mg·L-1）会促进小白菜（Brassica.campestrisssp.chinensis）的生长，增加其生物量，而高质量浓度的Se（≥2.5 mg·L-1）则会抑制其生长；Cabral 等［6］对水稻（Oryza sativa）施加Na2SeO3的研究发现，高浓度的Se处理明显增强了水稻抗氧化酶系统的活性，但Se 对植物在代谢水平影响的报道较少。植物代谢物的研究可以准确反映植物在不同生长时期或受到某种刺激前后的小分子代谢产物的变化，从而得到植物在特定状态下代谢规律的变化。研究植物在不同浓度Se 处理下的代谢变化，对于揭示植物在面对低/高Se 时做出不同反应的机制具有重要意义。

斜茎黄芪（Astragalus adsurgens）是豆科（Legu⁃minosae）黄芪属（Astragalus）多年生草本植物，其适应性强，产量高、品质好、营养丰富［7］，同时它生物量大，根系发达，抗干旱和病虫害能力强，对Se具有较高的耐性和富集能力，在加拿大发现斜茎黄芪Se 积累量高达44 mg·kg-1［8］。在本研究以斜茎黄芪为试验材料，在水培条件下研究不同浓度Se 处理对其生长形态、光合参数以及初生代谢物质等的影响，以期在代谢水平上探讨硒富集植物对Se的响应机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

斜茎黄芪种子购买自河北省安国市元泰药用植物种子站。色谱级甲醇、乙腈购于北京百灵威化学有限公司，去离子水（电阻率高于18.2 MΩ·cm-1）取 自Milli-Q 水 纯 化 系 统（Millipore，USA）。

1.2 试验方法

1.2.1 培养及Se处理过程

精选出籽粒饱满、均匀的黄芪种子，用体积分数10%次氯酸钠溶液浸泡15 min 后，再用蒸馏水冲洗4～5 次以进行表面消毒。消毒后的种子在蒸馏水中吸胀24 h 后播种到湿润的蛭石中进行培养，培养过程中培养容器下部始终浸没在1/2强度的MS 营养液中。培养条件：每天保持14 h 光照，温度30 ℃（昼）/25 ℃（夜），相对湿度保持在70%左右。

幼苗出土3 周后进行Se 处理（Na2SeO3），共设置4 个处理质量浓度：0（CK）、5、20、100 μmol·L-1。每处理设3 个重复，每个重复包括24 株幼苗。处理时长为4周，处理期间每4 d更换一次处理液。

1.2.2 生长指标的测定

在处理结束后，将幼苗从培养容器中小心取出并用流水冲去培养介质，然后使用直尺（1 mm）测量幼苗植株的株高和根长，并记录数据。

1.2.3 光合参数的测定

光合色素的含量采用程贵文等［9］的方法。采用丙酮-无水乙醇混合液进行光合色素浸提来测定斜茎黄芪幼苗第二叶序叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量。叶片荧光参数参考Cen 等［10］的方法，采用便携式调制叶绿素荧光仪（PAM-2500，WALZ，Germinay）测定斜茎黄芪幼苗第三叶序叶片的叶绿素荧光参数。

1.2.4 幼苗Se元素含量测定

斜茎黄芪中Se 的含量参照马月花等［11］的方法。用去离子水将斜茎黄芪根系和地上部分冲洗干净后于80 ℃烘干。将烘干样品磨碎后，准确称取0.300 g 放入消煮管中，并加入10 mL 硝酸-高氯酸混合液（V∶V=5∶1）进行消煮。消煮结束后消煮管内加入5 mL 体积分数2%硝酸并温浴后转移至25 mL 容量瓶中，用体积分数2%硝酸溶液进行定容。

溶液样品中Se元素的含量使用电感耦合等离子发射光谱仪（ICP-OES Optima 8000）进行测定，其具体含量由标准曲线计算得出。

1.2.5 初生代谢产物分析

采用刘洋［12］的方法进行测定。初生代谢产物经衍生化后使用配备非极性DB-5 毛细管色谱柱（30 m×250 μm ID，J＆W Scientific，Folsom，CA）的Agilent 5975C 气相色谱-质谱仪（Agilent Technolo⁃gies，USA）进行质谱检测。高纯氦气被用作载气，载气流速1.0 mL·min-1。程序升温：8 ℃·min-1，60～125 ℃；4 ℃·min-1，125～210 ℃；5 ℃·min-1，210～270 ℃；10 ℃·min-1，270～305 ℃，305 ℃维持3 min。进样口的温度为260 ℃，EI 源温度为260 ℃，电压为-70 V。质量扫描范围：m/z50～600，延迟5 min开始采集，采集速度为20谱/s。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0 进行单因素方差分析，SIMCA-P14.1 进行偏最小二乘法分析（PLSDA），通过KEGG 数据库和MetaboAnalyst（http：//www.metaboanalyst.ca）数据库进行代谢途径的富集和筛选，并采用Simplot14.0 和Excel 软件绘制图表，R（www.r-project.org/）绘制气泡图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度Se 处理对斜茎黄芪幼苗生长的影响

在水培体系中，不同浓度的Se 处理4 周对斜茎黄芪幼苗生长产生了不同的影响。从图1 和图2A 可以看出，与对照相比，5 μmol·L-1Se 处理显著促进了斜茎黄芪的生长，处理结束后其根长和株高分别比对照增加了30.3%和32.9%。与低浓度Se 处理相反，100 μmol·L-1Se 处理后斜茎黄芪株高明显变矮，且植株底部叶片出现黄化萎蔫现象。与对照相比，100 μmol·L-1Se 处理下，斜茎黄芪株高和根长分别被抑制了73.2%和28.1%。通过根冠比数据（见图2B）发现，不同浓度Se 处理对根系和地上部的影响没有表现出明显差异。鉴于20 μmol·L-1Se处理并未显著影响斜茎黄芪幼苗根系和地上部的生长（见图1，图2：A～B），为了更好地研究外源Se供应在斜茎黄芪中扮演“双刃剑”的机制，我们在以下试验中将Se 处理设置为0、5 和100 μmol·L-1。

图1 不同浓度Se处理对斜茎黄芪形态的影响Fig.1 Effect of different Se treatments on the morphology of A.adsurgens seedlings

图2 不同浓度Se处理对斜茎黄芪生长的影响不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05），下同Fig.2 Effect of different Se treatments on the growth of A.adsurgens seedlings Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 lev⁃el，the same as below

2.2 不同质量浓度Se 处理对斜茎黄芪幼苗Se 吸收和转运的影响

随着Se 处理浓度的升高，斜茎黄芪根系和地上部Se 含量均逐步升高，且均与处理浓度呈良好的线性关系（见图3：A～B）。在相同处理浓度下，斜茎黄芪地上部Se 含量明显低于根系，在不同浓度Se 处理中Se 的转运系数均不高于0.20（见图3C）。此外，随着处理浓度的增加，根系中Se 向地上部转运的比例逐渐下降，100 μmol·L-1处 理 下Se 转 运 系 数 比5 μmol·L-1处 理 降 低 了83.5%。

图3 斜茎黄芪幼苗对Se的吸收和转运Fig.3 The adsorption and translocation of Se in A.adsurgens seedlings

2.3 不同质量浓度Se 处理对斜茎黄芪幼苗光合作用的影响

5 μmol·L-1Se 处理显著增加了斜茎黄芪新生叶片中叶绿素a 和叶绿素b 的含量，其中叶绿素b含量比对照升高了30.6%（见图4）。与低浓度Se处理不同，高浓度Se 处理下斜茎黄芪叶片中叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的含量均显著下降，与对照相比，3 种色素含量分别降低了52.4%、32.9%和48.9%。

图4 不同浓度Se处理对斜茎黄芪光合色素含量的影响Fig.4 Effects of Se treatments with different concentrations on the photosynthetic pigment content of A.adsurgens

通过测定不同浓度Se处理下叶片叶绿素荧光参数（见表1），发现5 μmol·L-1Se 处理下斜茎黄芪幼苗最小荧光值Fo、最大荧光值Fm以及最大量子产率Fv/Fm都出现了小幅下降，而PSⅡ实际的量子效率ΦPSⅡ和非光化学猝灭qN出现了小幅升高。在100 μmol·L-1Se处理下，最大量子产率Fv/Fm出现了显著降低，非光化学猝灭qN则比对照升高了14.7%。

表1 Se处理对斜茎黄芪幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Table 1 Effects of Se treatments on chlorophyll fluores‐cence parameters of A.adsurgens seedling

2.4 不同浓度Se处理对斜茎黄芪初生代谢的影响

我们对不同浓度Se处理后斜茎黄芪地上部和根系初级代谢产物物进行检测，通过比自带的NIST 数据库进行定性分析，最终共鉴定出101 种初生代谢产物。从图5中可以看出，通过有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法可以将每对处理组之间很好地分开。

图5 斜茎黄芪初生代谢产物PLS-DA得分图横坐标表示对X轴矩阵的解释率，纵坐标表示对Y轴矩阵的解释率；A，C.0 μmol·L-1 vs 5 μmol·L-1；B、D.0 μmol·L-1 vs 100 μmol·L-1Fig.5 PLS-DA scores of primary metabolites of A.adsurgens Abscissa：Interpretation rate of the X matrix；Ordinate：The interpretation rate of the Y matrix；A，C.0 μmo·lL-1 vs 5 μmo·lL-1；B，D.0 μmo·lL-1 vs 100 μmo·lL-1

依据PLS-DA 模型分析的第一主成分变量投影重要度（VIP>1）结合t检验的P值（P<0.05）对斜茎黄芪地上部和根系中不同质量浓度Se处理间差异代谢物进行筛选，筛选结果见表2。在不同处理浓度根系代谢物对比结果中，斜茎黄芪100 μmol·L-1Se 处理与对照组之间差异代谢物数量明显多于5 μmol·L-1Se 处理，前者共筛选得到29 个差异代谢物，其中Se 处理引起上调的差异代谢物有23个，引起下调的差异代谢物有6 个；后者筛选得到的差异代谢物数量仅为前者的51.7%。与根系结果不同，5 μmol·L-1Se处理与对照地上部间筛选得到的差异代谢物数量稍高于100 μmol·L-1。此外，我们发现在所有处理和部位中，Se 处理引起上调的差异代谢物数量均大大高于下调代谢物。

表2 不同浓度Se 处理下斜茎黄芪地上部和根部差异代谢物的数量Table 2 The amount of different metabolites in the shoots and roots of A. adsurgens under different concentrations of Se

将斜茎黄芪不同组织部位以及不同浓度Se处理间筛选出的差异化合物导入到KEGG 代谢通路中，分析后发现5 μmol·L-1处理与对照间地上部有19条代谢通路存在差异，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰-tRNA 生物合成、来自组氨酸和嘌呤的生物碱的生物合成、柠檬酸循环（TCA 循环）、光合生物中的碳固定等途径被显著富集，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢富集程度较大（见图6A）。参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径的差异代谢物有L-丙氨酸（上调12.34 倍）、L-谷氨酸（上调8.16 倍）、富马酸（上调6.95 倍）、琥珀酸（下调2.23 倍）。100 μmol·L-1处理与对照地上部共存在9条差异代谢通路，精氨酸和脯氨酸代谢以及鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生生物碱的生物合成这2条代谢通路被显著富集，参与这2条途径的差异代谢物质主要有L-谷氨酸（上调4.64 倍）、富马酸（下调2.23倍）和腐胺（上调2.08倍）（见图6B）。

在根系差异代谢物代谢通路富集中，5 μmol·L-1处理与对照之间只筛选出1 条有明显差异的代谢通路，即精氨酸和脯氨酸代谢途径（见图6C），参与此代谢途径的差异代谢物质有L-脯氨酸（上调9.31 倍）和腐胺（上调10.6 倍）。而在100 μmol·L-1处理与对照对比中共筛选出18 条代谢通路，乙醛酸和二羧酸代谢、鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生生物碱的生物合成、氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路被显著富集，其中乙醛酸和二羧酸代谢富集程度较大（见图6D）。参与乙醛酸和二羧酸代谢途径的差异代谢物有琥珀酸（上调21.95 倍）、酒石酸（上调15.46 倍）、乙醇酸（上调3.83倍）、草酸（上调1.75倍）。

图6 代谢通路分析气泡图A. 5 μmol·L-1—地上部；B. 100 μmol·L-1—地上部；C. 5 μmol·L-1—根系；D. 100 μmol·L-1—根系；Count.富集到代谢通路上的代谢物个数；-log1（0Pvalue）.代谢通路中检测到的差异代谢物与该通路中总代谢物的比值，颜色越深表示富集程度越大Fig.6 Metabolic pathway analysis bubble chart A. 5 μmol·L-1—Shoot；B. 100 μmol·L-1—Shoot；C. 5 μmol·L-1—Root；D. 100 μmol·L-1—Root；Count.The number of metabolites enriched in the metabolic pathway；-log1（0Pvalue）.The ratio of the differential metabolites detected in the metabolic pathway to the total metabolites in the path⁃way，the darker the color，the greater the enrichment degree

3 讨论

低浓度的Se 对多种植物来说是一种有益元素，但是Se 在较高浓度时可以引起植物的中毒反应，最为基本的可见症状为生长速率降低、叶片萎黄特别是在年轻的叶子中等，郭元坤等［13］研究发现，低浓度Se（≤25 mg·L-1）能显著促进野葛幼苗的生长，提高叶绿素的含量，而高浓度Se（≥25 mg·L-1）则会抑制其生长。本研究得到了相似的结果：5 μmol·L-1Se 处理后显著促进了斜茎黄芪的生长，而在100 μmol·L-1Se 处理下，斜茎黄芪幼苗生长受到了显著抑制，其根系长度和地上部高度均明显降低。在多种胁迫条件下，例如干旱、盐度和高温或低温，会破坏光合装置的组成部分，并降低其光合能力［14］。叶绿素荧光是检测植物光化学反应状况的重要参数，可准确揭示植物光系统对光能的吸收、传递、耗散和分配等情况［15-16］。在本研究中，不同浓度Se 处理下斜茎黄芪幼苗的生长状况与其光合色素含量以及叶绿素荧光参数表现出了较好的一致性，低浓度Se 处理下新叶光合色素含量升高和PSⅡ实际的量子效率均出现升高，说明低浓度Se显著促进了斜茎黄芪幼苗的光合作用从而提高其生长速率。与此相反，在高浓度Se 处理下，斜茎黄芪叶片光合色素含量和最大量子产率Fv/Fm降低，非光化学猝灭qN 升高，表明高浓度Se处理严重影响了斜茎黄芪幼苗的光合作用并最终导致了其生长减缓。

黄芪属多种植物对Se具有较高的耐性和富集能力［17］，斜茎黄芪即为其中一种。研究表明，植物可以从环境中吸收无机硒，并将其转化为有机硒储存起来，如：王永勤等［18］发现对大蒜无论是土壤施Se、叶面喷施Se、浸种，均能不同程度增加大蒜中Se 的含量。我们的研究结果显示，20 μmol·L-1Se 处理4 周并未对斜茎黄芪根系和地上部生长造成显著影响，并且其根系和地上部Se 含量与处理浓度间呈良好的线性关系，表明斜茎黄芪幼苗对Se 胁迫具有较高的耐性。此外，我们发现斜茎黄芪吸收的Se 主要积累在根部，向地上部分转运的比例相对较少，且随着Se处理浓度的升高，转运系数出现明显下降，说明斜茎黄芪可以通过限制根系吸收的Se 向地上部的转运来减少Se 处理下地上部受到的伤害，从而提高植株对Se处理的耐性。

当植物体所处的环境发生变化时，植物体的代谢途径会随着发生变化，从而引起代谢产物的类型和含量也会发生改变。本研究中，低浓度Se处理下，斜茎黄芪根系和地上部多个与氨基酸代谢相关的途径被上调，如根系中的脯氨酸和精氨酸途径以及地上部的谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸途径。植物体内氨基酸在蛋白质合成中起着重要作用，同时对氮源的同化和库源的转运也发挥了重要功能。因此，我们推测这些氨基酸代谢途径的增强与低浓度下Se促进斜茎黄芪生长具有着密切联系。与低浓度Se 处理不同，100 μmol·L-1Se处理更多的引起了与次生物质合成密切相关的代谢途径的上调，如精氨酸和脯氨酸代谢、鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生生物碱的生物合成以及乙醛酸和二羧酸代谢等代谢途径。植物在面临不利环境条件时，会将更多的物质和能量用于次生代谢过程，以减轻不利环境条件对植物体造成的伤害。斜茎黄芪在高浓度Se 处理时，引起根系和地上部在次生代谢中扮演重要角色的初生代谢产物含量的升高，这一方面会导致用于生长发育的初生代谢产物的减少，从而延缓植物生长速度，另一方面则加强了次生代谢进程，提高斜茎黄芪幼苗对Se胁迫的抵抗能力。

4 结论

斜茎黄芪对不同浓度Se 处理具有不同的响应，低浓度Se 促进了幼苗生长，而高浓度Se 则抑制了幼苗生长。低浓度和高浓度Se对斜茎黄芪幼苗生长的影响均与促进或降低了叶片光合作用能力相关。通过对斜茎黄芪的初级代谢产物进行分析发现，斜茎黄芪主要通过降低根系吸收的Se 向地上部的运输以及提高植株与次生代谢相关的初生代谢物质代谢水平来提高幼苗对高浓度Se处理的适应能力。