UHPLC-MS/MS法同时测定热毒宁注射液中5种成分

2022-12-04王超众南俊伶董艳丽王萌萌

中成药 2022年10期

王超众，南俊伶，董艳丽，王萌萌,3*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔市药品检验中心，黑龙江齐齐哈尔 161005；3.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔 161005)

热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有限公司生产的中药注射剂[1]，由金银花、栀子、青蒿3味药材制成[2]，具有清热、疏风、解毒的功效[3]，用于治疗外感风热所致感冒、咳嗽，上呼吸道感染、急性支气管炎等疾病[4]，临床上退热作用迅速，抗病毒效果显著[5-6]，属于国家二类新药[7-8]，并在治疗急性气管炎、上呼吸道感染方面取得了一定疗效[9-11]。在新冠肺炎疫情流行期间，热毒宁注射液已被广泛应用于危重型患者的治疗[12-15]，故有必要对该制剂进行严格的质量控制。

在热毒宁注射液现行标准中，分别采用2个HPLC系统测定栀子苷、绿原酸的含量，操作繁琐，另外还有应用高效毛细管电泳法[16]、紫外分光光度法[17]、高效液相色谱法[18-20]、超高效液相色谱法[21]等手段进行含量测定，但尚无关于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UHPLC-MS/MS)法的相关报道。因此，本实验建立UHPLC-MS/MS法同时测定热毒宁注射液中栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸的含量，符合中药质量控制标准的发展趋势[22]，可为该制剂用药安全提供可靠的技术保障。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Vanquish H型高效液相色谱仪(配置Xcalibur 3.0.63工作站)、Thermo TSQ Quantum Access型质谱仪(配置Chromeleon 7.2.10工作站)(美国Thermo公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司，精度0.01 mg)；KQ-500VDV型台式三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 W，频率45 kHz)；DFY-400型高速万能粉碎机(上海比朗仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物栀子苷(批号110749-201919，纯度97.1%)、绿原酸(批号110753-202018，纯度96.1%)对照品(中国食品药品检定研究院)；京尼平龙胆双糖苷(批号7382，纯度≥98.0%)、新绿原酸(批号7864，纯度≥98.0%)对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司)；隐绿原酸对照品(成都普思生物科技股份有限公司，批号PS14011403，纯度≥99.0%)。热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号210601、210824、190805)。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-MS/MS分析条件 ACES C18Dim色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～7 min，5%～25%A；7～9 min，25%～65%A；9～10 min，65%～100%A；10～12 min，100%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL；电喷雾离子源，正负离子检测；选择反应监测(SRM)模式；雾化气N2；鞘气体积流量10 bar(1 bar=100 kPa)；辅助气体积流量30 bar；源电压4 000 V(+)、3 500 V(-)；毛细管温度270 ℃，其他质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸对照品适量，50%甲醇制成1 mg/mL溶液，分别精密量取适量，50%甲醇制成质量浓度分别为1.022 5、0.505 7、0.802 4、0.301 8、0.301 0 μg/mL的贮备液，分别精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液精密量取本品1 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取0.2 mL，置于200 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 空白溶液取50%甲醇，滤过，即得。

2.3 系统适应性试验取“2.2”项下对照品、供试品、空白溶液适量，在“2.1”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液色谱图中各成分保留时间与对照品溶液一致，空白色谱图无干扰峰出现，表明该方法系统适应性良好。

2.4 线性关系考察取“2.2.1”项下贮备液，50%甲醇依次稀释100、50、20、10、5、2.5、2倍，得到含栀子苷10.22、20.45、51.12、102.25、204.49、408.99、511.230 ng/mL，京尼平龙胆双糖苷5.06、10.11、25.28、50.57、101.14、202.27、252.84 ng/mL，绿原酸8.02、16.05、40.12、80.24、160.49、320.97、401.22 ng/mL，新绿原酸3.02、6.04、15.09、30.18、60.37、120.74、150.92 ng/mL，隐绿原酸3.01、6.02、15.05、30.10、60.19、120.38、150.48 ng/mL的对照品溶液，在“2.1”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5 精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项条件下进样测定6次，测得栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸峰面积RSD分别为1.21%、2.06%、1.07%、1.56%、0.97%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取本品(批号210601)适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、6、10、16、24 h在“2.1”项条件下进样测定，测得栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸峰面积RSD分别为3.47%、4.26%、2.59%、2.67%、3.13%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验取本品(批号210601)适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，在“2.1”项条件下进样测定，测得栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含量RSD分别为2.10%、1.69%、1.36%、2.08%、1.57%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密量取各成分含量已知的本品(批号210601)0.5 mL，共6份，置于50 mL量瓶中，分别精密加入“2.1”项下1 mg/mL溶液5、2.5、3.3、1.2、1.3 mL，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取0.2 mL，置于200 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，在“2.1”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品含量测定取3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，外标法计算各成分含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(mg/mL，n=3)

3 讨论

3.1 紫外检测器、质谱检测器比较热毒宁注射液组成复杂，杂质峰对主峰影响较大，并且5种成分检测波长不同，紫外检测器很难做到同时检测。因此，本实验采用质谱检测器，可使结果更准确。

3.2 流动相选择本实验考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-10 mmol/L醋酸铵、乙腈-5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)，发现乙腈-5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)洗脱时效果较好。

3.3 检测离子选择栀子苷、京尼平龙胆双糖苷均为环烯醚萜类化合物[23]，在本实验条件下得到1个氨基，形成m/z406.2、568.4的[M+NH4]+准分子离子峰，碰撞后裂解的二级质谱中m/z209.2峰响应值最高，即两者共有子离子[C11O4H13]+；绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸主要为咖啡酸、香豆酸、福林酸与奎宁酸形成的缩合型酚酸，由于酯化部位及酸酐种类、数量的不同，使得绿原酸类物质形成了以上3种同分异构体[24]，在本实验条件下易失去1个质子，形成m/z353.1的[M-H]-准分子离子峰，碰撞后裂解的二级质谱中m/z191.1峰响应值最高，即三者共有子离子[C7O6H11]-。