嘧菌酯与戊唑醇混配对桑褐斑病病菌的联合毒力

苏振国 江秀均 李玲利 杨振国 柴建萍 白兴荣

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

桑褐斑病是云南省桑园主要流行发生的2种病害(桑白粉病、桑褐斑病)之一，云南桑区的桑褐斑病主要由半知菌亚门的桑褐斑壳丰孢菌[Phloeosporamaculans(Bereng.)Allesch](无性态)侵染引起[1-4]，发病时桑叶穿孔腐烂，病叶的内含物蛋白、脂肪、纤维、糖分、氨基酸等营养物质含量降低，从而造成桑叶品质下降影响家蚕的生长发育[5-6]，目前生产上在桑褐斑病发生期采用取代苯基类甲基硫菌灵和苯并咪唑类多菌灵化学药剂多次施药的方法防治该病害，药剂使用量大，但防治效果不理想，且长期使用易产生抗药性[7-12]；对桑褐斑病病原菌的生物学和致病性研究表明，分生孢子和分生孢子形成的厚垣孢子是桑褐斑病最主要的侵染传播源[13]，在未发病或发病初期选用对病原孢子抑制活性高兼具抑制菌丝活性的药剂施药可以预防该病大面积发生危害，延缓病原菌抗药性的产生和减少化学药剂的使用量。为此，我们结合前期室内药剂筛选试验，以对桑褐斑病病原菌分生孢子抑制活性高的甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)杀菌剂嘧菌酯和菌丝抑制活性高的甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)杀菌剂戊唑醇通过室内毒力测定获得对桑树褐斑病最优复配配比，以减少防治桑树褐斑病药剂的使用量、降低对环境的污染和延缓桑树褐斑病病菌抗药性的产生。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂 98%嘧菌酯原药，农药登记证号PD20140138，97%戊唑醇原药，农药登记证号PD20082107，均为江苏七洲绿色化工股份有限公司产品；丙酮，分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；吐温80，分析纯，天津市风船化学试剂有限公司产品。

1.1.2 供试菌株 试验菌株为桑褐斑壳丰孢菌，来源于云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，用于培养保存菌株和制作混药平板。

1.2 试验方法

1.2.1 2种杀菌剂单剂对桑褐斑壳丰孢菌菌丝的毒力测定 采用抑制菌丝法测定2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌的毒力，具体操作如下：在无菌条件下，将供试杀菌剂溶于少量丙酮试剂中，用0.1%吐温水溶液稀释成6个浓度，将配好的杀菌剂药液取2 mL加入23 mL PDA培养基中制成混药平板，嘧菌酯混药平板的嘧菌酯浓度分别为4.00 mg/L、2.00 mg/L、1.00 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.13 mg/L，戊唑醇混药平板的戊唑醇浓度分别为2.00 mg/L、1.00 mg/L，0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.13 mg/L、0.06 mg/L，以加入等量无菌水代替药物的平板作为对照平板，设3个平行试验。用内径为6 mm的打孔器在预先培养14 d的桑褐斑壳丰孢菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼放入含药平板中央。将接菌的培养皿置于25 ℃恒温箱中培养，定期观察，14 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂处理对病菌菌丝生长的抑制率并测算半抑制浓度(EC50)值。计算公式如下：抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100。

1.2.2 2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌分生孢子的毒力测定 将桑褐斑壳丰孢菌菌株在PDA平板上25 ℃培养14 d后，用无菌水洗下分生孢子，4层纱布过滤除去菌丝，将滤液在5 000 r/min下离心10 min，去除上清液，将分生孢子重悬于无菌水中，用血球计数板观察计算孢子数量和浓度，用无菌水将孢子浓度调节至106个/mL，制成分生孢子悬浮液。取配制好的0.05 mL杀菌剂和0.05 mL浓度为106个/mL的分生孢子悬浮液混合均匀加入到灭菌的双凹玻片的凹槽中，混合后嘧菌酯的浓度分别为50.00 mg/L、25.00 mg/L、12.50 mg/L、6.25 mg/L、3.13 mg/L，混合后戊唑醇的浓度分别为50.00 mg/L、25.00 mg/L、12.50 mg/L、6.25 mg/L、3.13 mg/L，加盖保湿放入25 ℃恒温箱中培养，以0.1%吐温水溶液处理的分生孢子悬浮液为对照，设3个重复试验，24 h后显微镜下观察记录不同药剂及对照的分生孢子萌发结果并测算EC50值。计算公式如下：抑制率(%)=(对照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率)/对照组孢子萌发率×100。

1.2.3 2种杀菌剂联合抑制桑褐斑壳丰孢菌的最佳配比筛选 以单剂嘧菌酯和戊唑醇的近似EC50分别取2.50 mg/L嘧菌酯和0.25 mg/L戊唑醇为基础浓度，采用交互测定法进行最佳配比筛选，将2种药液按体积比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10分别混合，配制出不同体积比的混合溶液后，测定各混合溶液对桑褐斑病病原菌处理后的抑制率，再根据以下公式计算各配比的预期抑制率和毒性比率：预期抑制率(%)=嘧菌酯EC50值剂量实际抑制率×配比中嘧菌酯EC50值剂量百分比+戊唑醇EC50值剂量实际抑制率×配比中戊唑醇EC50值剂量百分比；毒性比率=实际抑制率/预期抑制率。毒性比率大于1.25时，表现为增效作用；毒性比率小于0.75时，表现为拮抗作用；毒性比率在1左右时，为相加作用；在此基础上筛选得到最佳体积配比[14]。

1.2.4 2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌最佳配比的联合毒力测定 将确定的最佳体积配比换算为质量配比制成2种杀菌剂的混剂，并测定混配药液对桑褐斑壳丰孢菌的菌丝毒力，具体测定方法同1.2.1项的试验方法，混配药液平板的药物浓度设为5.00 mg/L、2.50 mg/L，1.25 mg/L、0.63 mg/L、0.31 mg/L等5个浓度梯度，以加入等量无菌水代替药液的平板作为对照，设3次重复，计算各混配药剂的EC50。以上述测定结果为基础，依据共毒系数(CTC)值>120为增效作用，介于80～120之间为相加作用，CTC值<80为拮抗作用[15]进行判断，具体计算公式如下：毒力指数(TI)=标准药剂的EC50/供试药剂的EC50×100；实测混剂的毒力指数(ATI)=标准药剂的EC50/混剂的EC50×100；混配药剂的理论毒力指数(TTI)=TIA×PA+TIB×PB，式中TIA和TIB分别表示单剂A与B的毒力指数，PA和PB分别表示单剂A与B在混剂中的质量分数；混剂的CTC=混剂ATI/混剂TTI×100。

1.3 数据处理与分析方法

采用Excel2007软件对数据进行统计，计算各处理平均菌落直径和平均抑制率，采用DPS9.50软件对药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率机率值进行回归分析，求出各单剂及其不同配比混剂的毒力回归方程、相关系数(r)和EC50。

2 结果与分析

2.1 2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌的菌丝和分生孢子的抑制作用

测定2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌的菌丝生长均具有较强的抑制活性，嘧菌酯对菌丝的EC50为2.27 mg/L，戊唑醇对菌丝的EC50为0.26 mg/L，嘧菌酯抑制分生孢子的EC50为12.84 mg/L，戊唑醇抑制分生孢子的EC50为20.47 mg/L(表1)。

表1 2种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢菌菌丝和分生孢子的毒力

2.2 2种杀菌剂混配对桑褐斑壳丰孢菌的最佳配比

按照不同配比混配药液对桑褐斑壳丰孢菌菌丝的抑制活性，以毒性比率法评价其是否具有增效作用，结果表明，在所选配比中，嘧菌酯和戊唑醇的EC50值在体积比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9时对桑褐斑病病菌的毒性比率分别为1.52、1.86、1.69、1.78、1.75、1.73、1.70、1.66、1.65，其中在体积比分别为8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7(质量比35∶1～4∶1)时的毒性比率均大于1.69，表现为增效作用(表2)。综合考虑，本次试验划定质量比50∶1～5∶1作为嘧菌酯和戊唑醇2种杀菌剂混配的毒力测定范围。

表2 2种杀菌剂不同配比混合对桑褐斑壳丰孢菌的毒性比率

2.3 2种杀菌剂不同配比对桑褐斑壳丰孢菌的毒力

以共毒系数法测定了各配比的增效情况(表3)，嘧菌酯和戊唑醇复配在质量比为50∶1～5∶1之间共毒系数均大于120，均具有增效作用，其中嘧菌酯∶戊唑醇质量比为25∶1时，共毒系数最高为260.91，EC50为0.67 mg/L；以后共毒系数由大到小依次为嘧菌酯∶戊唑醇的质量比在10∶1时为250.61，EC50为0.53 mg/L；嘧菌酯∶戊唑醇的质量比在50∶1时为205.52，EC50为0.94 mg/L；嘧菌酯∶戊唑醇的质量比在5∶1时为198.65，EC50为0.50 mg/L。

表3 嘧菌酯和戊唑醇不同比率混剂对桑褐斑壳丰孢的联合毒力

3 小结与讨论

桑叶是家蚕饲料的唯一可靠来源，桑园用药不仅要达到防治病害的效果，同时要确保对家蚕的安全，与传统的作物用药相比桑园用药对安全有效的药剂依赖性更强，使用周期较长易使病原菌产生抗药性[16]。结合桑褐斑病的病原传播方式和我们前期的田间试验调查发现，长期使用甲基硫菌灵作为防治药剂的地块其防治效果已不再理想[17]；因此，筛选新的对家蚕低毒的杀菌剂是提高桑褐斑病防效和病害抗性治理的可行途径。试验中选用对分生孢子和菌丝兼具抑制性的不同作用机制杀菌剂嘧菌酯和戊唑醇混用增加杀菌剂的靶标位点可以降低病原菌的抗性选择压力，并且2种药剂在病原菌内的吸收、分布、降解的时间不同，可以在病原菌各生长阶段发挥不同的抑菌活性。试验中以嘧菌酯与戊唑醇质量比在25∶1时共毒系数最高为260.91，EC50为0.67 mg/L，按照田间施药标准为室内的，结合前期我们对2种药剂的家蚕急性毒力测定表明其对家蚕属于低风险药剂，结合慢性毒性的报道其对非靶标家蚕产生慢性毒性风险的剂量低于其防病的剂量[18-19]，虽然2种药剂对家蚕的毒性较低且对桑褐斑病防治效果较好，但本试验是在室内进行的，进一步的应用还需在田间开展评价试验。