油松枯梢病菌孢子萌发率测定方法探索

史丹阳，任晓婧，魏步飞，许子怡，孙玉琴，李会平，4

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071001；2.黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025；3.木兰县太平种子林林场，黑龙江 木兰 151900;4.河北省城市森林健康技术创新中心，河北 保定 071001)

油松Pinustabuliformis为中国特有松科针叶常绿乔木，具有很强的抗寒抗旱能力，在我国多省均有分布，是我国北方地区非常重要的造林和绿化景观树种[1]。油松对山地植被恢复也起着十分重要的作用，具有生态服务功能[2]。

2004年首次在秦皇岛市联峰山发现油松枯梢病，病原菌为松球壳孢菌Sphaeropsissapinea[3]。该病原菌的分生孢子器为黑色球形，半埋生于松梢表皮层，分生孢子长椭圆形，单胞或多胞，浅棕色，着生在分生孢子器内[4]。在研究该病菌的越冬场所、侵入途径、侵染过程，筛选化学防治和生物防治药剂的过程中，孢子萌发试验是一项非常重要的工作[5-6]。传统方法是在获得分生孢子器的基础上，配制孢子悬浮液，采用悬滴法、水琼脂表面萌发法、培养皿萌发法、琼脂平板表面萌发法等测定孢子萌发率，这是一项非常繁琐且复杂的工作[7]。而且，该病菌不易在人工培养基中产生分生孢子器，因此获得纯净足量的分生孢子也是一项具有挑战性的工作。前期研究发现可以在灭菌松针上快速诱导出大量分生孢子器[8]，这些分生孢子器在适宜条件下即开始萌发产生菌丝。因此笔者探索以分生孢子器萌发率代替孢子萌发率的可能及两者之间的关系，以期为油松枯梢病分生孢子萌发率的测定提供一种快速、便捷的方法。

1 材料与方法

1.1试验材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea分离自秦皇岛联峰山的油松枯梢病株病梢，由河北农业大学林学院林木病理实验室提供。分生孢子器诱导用松针，采自秦皇岛联峰山公园生长健壮的2 a生油松。

1.2试验方法

1.2.1分生孢子器诱导和孢子悬浮液制备 将松针用自来水冲洗后，自然风干，切成约1 cm的小段，置于培养皿中，加少量蒸馏水以保持其湿润，121 ℃高压灭菌25 min，连续高压灭菌3次，供试菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长3 d后，接种灭菌松针；在25 ℃恒温光照培养箱内培养，待松针的分生孢子器和分生孢子成熟后取出，放置在无菌培养皿中备用。

用接种针将松针上的分生孢子器轻轻挑下，无菌水浸泡10 min后取出，使分生孢子完全释放于无菌水中，配成浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。

1.2.2悬滴法测定分生孢子萌发率 将孢子悬浮液滴于盖玻片上，翻转平放于凹玻片凹槽上，置于大培养皿中，用棉球蘸无菌水保湿。25 ℃恒温光照培养2～50 h，每隔2 h观察1次孢子萌发率。每次观察5个载玻片作为重复，每个载玻片观察5个视野，每次观察500～800个孢子。芽管长度超过孢子直径长度(指直径最小的一边)的一半，视为已经萌发。

分生孢子萌发率(%)=萌发的孢子数/孢子总数×100

1.2.3分生孢子器萌发率测定 将至少有80个分生孢子器的油松松针用无菌水冲洗后，0.1%的升汞表面消毒30 s，灭菌水冲洗3次，置于铺有3层灭菌湿滤纸的培养皿中，LRH-250-G光照培养箱中25 ℃恒温保湿培养2～50 h，每隔2 h光学显微镜下观察其萌发情况，每次观察5个油松松针。有菌丝自分生孢子器周围伸出，长度超过分生孢子器直径的一半，视为已经萌发。

分生孢子器萌发率(%)=产生菌丝的分生孢子器/分生孢子器总数×100

1.3数据分析 利用一元线性回归分析，用SPSS软件对分生孢子器萌发率和孢子萌发率进行线性回归分析。

2 结果与分析

2.1分生孢子器诱导结果 灭菌油松松针接种于PDA培养基上15 d后开始出现黑色的突起，即分生孢子器(图1)。分生孢子器直径为0.5～1.4 mm，黑色球形，半埋生在松针表皮层，后突出外露。

图1 油松枯梢病菌分生孢子器Fig.1 Pycnidia of S.sapinea

2.2分生孢子萌发过程 悬滴法测定的分生孢子萌发过程如图2所示。分生孢子在处理2 h后开始萌发，长出芽管；随着时间的延长，芽管的长度逐渐增加。孢子萌发率随着时间的增长逐渐升高，2 h时孢子萌发率为22.3%，10 h时为34.4%，20 h时为55.3%，40 h时为78.2%，50 h时孢子萌发率趋于稳定，达84.3%(表1)。

A.未萌发Not germination；B.萌发2 h Germinated for 2 hours；C.萌发6 h Germinated for 6 hours；D.萌发8 h Germinated for 8 hours

2.3分生孢子器萌发过程 生有分生孢子器的松针保湿培养后，逐渐在分生孢子器的周围观察到菌丝体(图3)。

处理后2 h，分生孢子器开始萌发，周围可观察到少量菌丝，萌发率为3.9%，随着时间的延长，菌丝逐渐增多、长度增加，萌发率逐渐增高，20 h时为39.0%，40 h为64.1%，到50 h时萌发率趋于稳定，达80.0%(表1)。

表1 不同时间的分生孢子和分生孢子器萌发率Tab.1 Germination rate of conidia and pycnidia at different time

A.未萌发Not germination；B.萌发2 h Germinated for 2 hours；C.萌发6 h Germinated for 6 hours；D.萌发10 h Germinated for 10 hours

2.4分生孢子萌发率与分生孢子器萌发率的关系 分生孢子器萌发率和孢子萌发率之间具有线性关系，可用一元回归方程y=0.195+0.864x表示，其中y为孢子萌发率，0.195为回归截距，0.864为回归系数(即倾向趋势)，x为分生孢子器萌发率，分生孢子的萌发率和分生孢子器萌发率之间的线性关系较好(图4)。

方差分析表明，分生孢子器萌发率与孢子萌发率之间具有线性关系(df=23，F=1 113.559，P=0<0.05)。

图4 分生孢子萌发率与分生孢子器萌发率之间的一元线性回归Fig.4 One variable linear regression of the relationship between conidia germination rate and pycnidia germination rate

利用回归方程y=0.195+0.864x，对分生孢子的萌发率进行预测，预测值和实际值见表2。

可以看出利用该方程对分生孢子萌发率进行预测时，预测值和实际值误差较小，可以用于实际孢子萌发率测定研究中(表2)。

表2 分生孢子萌发率预测值和实际值比较Tab.2 Comparison between predicted and actual values of conidia germination rate

3 结论与讨论

本研究中采用了分生孢子器萌发法和一元线性回归分析，通过用SPSS软件对油松枯梢病分生孢子器萌发率和孢子萌发率进行线性回归分析。分生孢子器萌发率和孢子萌发率之间具有线性关系，两者的比值围绕一定值波动，可以近似地用一元回归方程表示。利用该回归方程测算油松枯梢病分生孢子萌发率，方法简便，可以作为孢子萌发率测定的代用方法。对于其他可以产生子实体的病原真菌孢子萌发率的测定，也可以借鉴此方法，但由于不同真菌的萌发要求和萌发过程不同，其回归方程需要单独摸索。