四川省套作玉米茎腐病致病镰孢菌的分离与鉴定

周欢欢，严 雳，王对平，雍太文，2，龚国淑，尚 静，2，杨文钰，2，常小丽，2*

（1.四川农业大学农学院，成都 611130；2.四川省作物带状复合种植工程技术研究中心，成都 611130）

玉米茎腐病（maize stalk rot）是世界玉米生产中普遍发生的一种真菌病害[1-2]。自20世纪70年代在我国首次报道后，相继在黑龙江、吉林、河北、河南、陕西、广西等20多个省区发病，该病可以引起玉米早衰、产量降低，田间一般发病率为10%～20%，严重地块高达70%以上，甚至植株完全枯死[3]。据国内外研究报道[4-6]，镰孢菌是引起玉米茎腐病的主要致病菌之一，其中轮枝镰孢菌F.verticillioides、层生镰孢菌F.proliferatum、禾谷镰孢菌F.graminearum、胶孢镰孢菌F.subglutinans、F.temperatum等，不仅可危害玉米产量和品质，而且其产生的毒素对人、畜健康造成危害[7-10]。受气候条件、耕作栽培方式（保护性耕作、秸秆还田等）及玉米品种更替的影响，我国不同地区玉米茎腐病的优势致病菌存在差异[11]。

近年来，杨文钰等[12]在传统间套作基础上，系统研究了作物品种选配、田间优化配置，形成了玉米-大豆带状复合种植的核心与配套技术，大大提高土地生产率与光肥利用率，改善农田生态系统，降低病虫草害损失率，与净作玉米相比，在玉米不减产的情况下多收一季大豆，实现了经济、生态与农业可持续发展相统一[13-14]，目前在我国西南、西北、黄淮海等地区推广面积逐年增加。但关于玉米-大豆带状套作下玉米茎腐病的发生情况及病原菌种类尚不清楚。本研究对四川省玉米大豆带状套作4个主要栽培县（市）的玉米茎腐病进行调查及取样，采用形态特征和分子鉴定对病原菌进行鉴定和致病性检测，以便掌握该模式下玉米茎腐病的发生情况及病原菌类群，为玉米大豆带状套作下玉米茎腐病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

2016—2017年间分别对四川省雅安市、成都市崇州区、自贡市荣县和眉山市仁寿县4个市（县）的玉米-大豆带状套作栽培田中玉米茎腐病病样进行采集。选取病状典型，且茎部未完全腐烂的病样本112份，进行室内组织分离、纯化及鉴定。

1.1.2 供试植物

室内病原菌致病性检测采用玉米品种登海605。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）∶200 g马铃薯，20 g琼脂，20 g葡萄糖，用水定容至1 L。羧甲基纤维素钠培养基（CMS）∶羧甲基纤维素钠7.5 g，酵母膏0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g和硫酸镁0.25 g，用水定容至1 L。清水琼脂培养基（WA）∶10 g琼脂，10 g葡萄糖，用水定容至1 L。以上培养基在121℃高压灭菌30 min，冷却待用。

1.2 试验方法

1.2.1 田间病害调查

2016—2017年间分别对四川省雅安市、成都市崇州区、自贡市荣县和眉山市仁寿县4个市（县）的玉米-大豆带状套作栽培田进行调查及取样。其中，玉米-大豆带状套作栽培具体试验设计为：玉米于3月底4月初采用宽窄行种植，窄行40 cm，宽行160 cm，株距10 cm；大豆于6月上旬播种于玉米宽行，种植2行，行距40 cm，株距20 cm。玉米底肥穴施尿素330 kg/hm2、过磷酸钙750 kg/hm2和氯化钾 150 kg/hm2，在大喇叭口期追施尿素330 kg/hm2；大豆底肥施尿素65 kg/hm2、过磷酸钙 420 kg/hm2、氯化钾 70 kg/hm2。其他按照常规进行管理。其中，玉米品种为登海605，大豆品种为南豆12。

于玉米乳熟期分别在4个市（县）选择3～5个主栽区，采用随机抽样调查玉米茎腐病的发病情况，参照李春霞等[15]病情级别标准，计算发病率及病情指数，公式如下：

1.2.2 病原菌分离与纯化

剪取玉米茎腐病病样的茎部组织约0.5 cm×0.5 cm，依次用75%乙醇消毒30 s，5%NaClO消毒45 s，无菌水冲洗3次，在灭菌滤纸充分晾干后，移至9 cm的PDA平板上，每皿4个，置于25℃下培养3～5 d后观察。挑取镰孢菌菌落外缘菌丝或者单个孢子法，获得镰孢菌纯化菌株。

1.2.3 病原菌鉴定

形态学鉴定：采用J.F.Leslie和B.A.Summerell的镰孢菌鉴定方法[16]，根据菌落形态、质地、菌丝是否有隔膜、分生孢子形态、大小对分离菌株进行鉴定。

分子鉴定：将获得的单孢菌株转移至PDA平板上，25℃培养7 d。参照何宛芹等[17]的CTAB法提取病原菌 DNA。采用 ITS1（5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和 ITS4（5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’）[18]对各镰孢菌rDNA-ITS基因的区段进行PCR扩增。反应体系：DNA 模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix12.5 μL、ddH2O 补至 25 μL。PCR 反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性 45 s；58℃退火 45 s；72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。采用 EF1-728F（5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和 EF1-986R（5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’）[19]对延长因子基因序列PCR扩增。反应体系：DNA模板1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 补至 25 μL。PCR 反应程序：95℃预变性 3 min，95℃变性 20 s，55 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送往上海生物工程有限公司测序。测序结果与NCBI基因库中已登录的镰孢菌序列进行Blast n比对，并将待测菌株序列和NCBI基因库中与之相似度较高的序列一起导入Clustal X软件序列比对。利用MEGA 6.0软件采用MP（Maximum-Parsimony）最大简约法构建系统发育树，自检次数为1 000次。

1.2.4 致病性测定

选取7个镰孢菌种的代表菌株各3株接种于PDA培养基上活化，置于25℃黑暗条件下培养3 d，待菌落长至培养皿边缘时，打菌饼（直径为5 mm）用于接种。玉米种子经75%乙醇消毒3 min，无菌水重新干净后，置于珍珠岩中，25℃在光照培养箱中培养。待玉米幼苗长至15 cm高时，参照戴浩[20]接种方法及评级标准，具体操作为：在玉米幼苗基部轻刺3个伤口，贴上菌饼，用保鲜膜缠绕，置于25℃光照培养箱内进行保湿培养，3 d后观察发病情况，每个代表菌株接种20株玉米幼苗。病情级别分4级，分别为：0级，健康，整株生长正常，未发病；1级，轻度发病，茎基部接种部位有轻微变色但未见明显病斑；3级，中度发病，茎基部变色明显，病斑明显拓展；5级，重度发病，病斑明显，茎基部几乎变褐，病斑环绕整个植株，有些茎基部完全腐烂，植株死亡。

1.3 数据处理分析

田间病害调查、菌株分离结果及致病性检测所得数据，均采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。检验方法为邓肯氏多重比较法，分析后各样本平均数间是否有显著差异。

2 结果与分析

2.1 田间调查结果

2016—2017年间，通过对四川省4个县市玉米大豆套作栽培下玉米茎腐病情况调查。结果显示玉米茎腐病在各地均有发生，但发病率和病情指数在不同地区存在差异。自贡市荣县的玉米茎腐病田间发病率均高于其他3个地区，发病率为11.52%，病情指数为13.49；雅安和崇州的玉米茎腐病田间表现发病率均较低，病情指数差异不显著；仁寿地区茎腐病相对其他地区发病率和病情指数最低（见表1）。总体来看，四川玉米大豆套作栽培下，玉米茎腐病发生较轻，平均发病率为8.45%，平均病情指数为11.16。

表1 四川省玉米大豆套作下玉米茎腐病发病情况Table 1 Occurrence status of maize stalk rot

2.2 病原菌分离及鉴定结果

2.2.1 玉米茎腐病镰孢菌鉴定结果

从供试103株玉米茎腐病分离菌株中获得71株镰孢菌，根据菌落形态和分生孢子形态（见图1），对菌株的基因区段进行PCR扩增及序列分析，选取部分镰孢菌序列与下载参照菌株序列构建ITS-EF多基因系统发育树，并以Bipolaris oryzae作外群，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树，如图2所示，供试菌株可分为2个大分支7个组，第1组Y9、Y12、Z1和C10与2个禾谷镰孢菌F.graminearum参考菌株聚在一起，相似性高达100%；第2组中Y1、C9、Z8和Z10与木贼镰孢菌F.equiseti参考菌株聚在同一分支；第3组中，Y16、C5和S8与轮枝镰孢菌F.verticillioides参考菌株相似性为54%；第4组中，C1、S3、Y5和S17与尖孢镰孢菌F.oxysporum参考菌株以相似性70%聚在一起；第5组中，Y11、C2和S5等7个菌株与3个腐皮镰孢菌F.solani参考菌株的序列相似性高达76%；第6组中，Y17、S1和Z53个菌株与藤仓镰孢菌F.fujikuroi参考菌株相似度为57%；最后一分支中，Y4、Y8和S2等16个菌株与层生镰孢菌F.proliferatum聚在一起，相似性达87%。结合形态特征和分子鉴定，可将分离获得的镰孢菌分为7种，包括层生镰孢菌、腐皮镰孢菌、轮枝镰孢菌、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、藤仓镰孢菌和木贼镰孢菌。

图1 玉米茎腐病镰孢菌菌落和分生孢子形态特征图Figure 1 Morphologies of colonies and microconidia of Fusarium isolates associated with maize stalk rot

2.2.2 套作玉米茎腐病各镰孢菌分离频率

在分离自玉米茎腐病的103株菌株中，共鉴定出7种镰孢菌（见表2）。其中，层生镰孢菌分离频率最高，为35.21%；腐皮和轮枝镰孢菌次之，分离频率分别为16.9%和15.49%，禾谷镰孢菌较低，而尖孢镰孢菌、藤仓镰孢菌和木贼镰孢菌最低，均不足10%。就不同地区而言，层生镰孢菌的分离频率均最高，为各地区优势镰孢菌；仁寿地区无禾谷镰孢菌和木贼镰孢菌，其他种类镰孢菌均有分布；崇州地区无藤仓镰孢菌分布；荣县地区禾谷镰孢菌的分离频率在4个区域中最高，无尖孢镰孢菌分布。综合来看，四川玉米大豆套作栽培下，玉米茎腐病镰孢菌的优势类群为层生镰孢菌、轮枝镰孢菌、腐皮镰孢菌和禾谷镰孢菌。

2.3 致病性测定

选取玉米茎腐病7种镰孢菌代表菌株各3株，采用玉米幼苗刺伤接种法进行致病性检测，结果如图4所示，在刺伤接种第3天后，不同病菌的致病力差异较大：禾谷镰孢菌致病性最强，病斑变褐、凹陷、病斑扩展明显。发病率高达95%且病情指数大于3；层生镰孢菌和轮枝镰孢菌接种后玉米茎秆部位出现水渍状病斑、变褐色，并伴有腐烂症状且有大量菌丝产生，发病率分别为91.67%和78.33%，病情指数均在2～3之间；木贼镰孢菌和尖孢镰孢菌发病率分别为81.67%和66.67%，病情指数为1.58和1.2，两种镰孢菌可引起玉米茎部出现部分水渍状变色、病斑扩增不明显，有少许菌丝出现。藤仓镰孢菌和腐皮镰孢菌也可引起茎秆部位变色但病状不明显，发病率分别为65%和71.67%，病情指数最低。因此分离获得各镰孢菌中，以禾谷镰孢菌致病性最强，层生镰孢菌和轮枝镰孢菌次之，尖孢镰孢菌和木贼镰孢菌致病性较弱，藤仓镰孢菌和腐皮镰孢菌致病性最弱。

表2 四川省玉豆套作下玉米茎腐病镰孢菌的分离频率Table 2 Isolation frequency of Fusarium species associated with corn stalk rot

图2 玉米茎腐病rDNA ITS和EF1-α序列系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree based on rDNA ITS and EF1-α fragments of Fusarium strains causing maize stalk rot

图3 镰孢菌接种引起的玉米发病症状Figure 3 Symptoms on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

3 讨论与结论

我国玉米茎腐病分布范围广，危害严重，轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌是我国玉米茎腐病的优势致病镰孢菌，但各地受不同因素影响，镰孢菌的种类及优势致病菌存在差异。本研究表明，四川玉米大豆套作栽培下玉米茎腐病镰孢菌的优势种为层生镰孢菌、轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌，但不同地区镰孢菌的种群结构及分布存在差异。

表3 镰孢菌代表菌株接种引起的玉米发病Table 3 Disease incidence and grade on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

晋齐鸣等[21]研究发现保护性免耕、少耕或秸秆还田等耕作方式，实行玉米宽窄行交替休闲耕作，可加重玉米茎腐病的发生。魏荐郦[22]于2013—2014年对四川省玉米茎腐病进行调查发现，平均发病率为17.18%；通过研究不同栽培模式对玉米茎腐病的影响发现，小麦-玉米套作田中玉米茎腐病的病情指数高于净作田，分别为17.38和13.32，秸秆还田处理后可加重两种栽培方式下玉米茎腐病的发生。本试验表明，四川玉米大豆带状套作栽培下玉米茎腐病平均发病率为8.45%，明显低于魏荐郦[22]在净作玉米和小麦-玉米套作田中的调查结果，表明玉米大豆带状套作不仅增产效果好，而且可有效地降低玉米茎腐病的发生。但总体来说，近年来四川玉米茎腐病发生情况不严重，可能与该地区多样化的玉米栽培方式有关。

在我国，玉米茎腐病的优势致病菌为禾谷镰孢菌复合群和轮枝镰孢菌[1，4，11]。Yu C.等[1]对我国东北地区玉米茎腐病的病原菌进行调查及鉴定发现，共分离获得9种镰孢菌，其中轮枝镰孢菌和禾谷镰孢菌为强致病菌株。袁红霞等[23]对河南省玉米茎腐病病原菌鉴定发现，禾谷镰孢菌分离频率和致病性最强，轮枝镰孢菌致病性较弱。何婧[24]通过对东北春玉米区、黄淮海夏玉米区以及云南、陕西等省部分地区的玉米茎腐病病原菌进行鉴定发现，轮枝镰孢菌为优势致病菌，其次为禾谷镰孢复合种。在四川省，魏荐郦[22]通过对净作和麦玉套作栽培下玉米茎腐病病原菌的鉴定结果表明，层生镰孢菌和木贼镰孢菌分离频率最高，为优势致病菌，轮枝镰孢菌是次优势致病菌，而禾谷镰孢菌和九州镰孢菌Fusarium kyushuense分离频率较低。与魏荐郦[22]分离的病原菌种类不完全相同，本试验从玉米大豆带状套作下共分离获得7种玉米茎腐病镰孢菌，除了层生镰孢菌、轮枝镰孢菌、禾谷镰孢菌、木贼镰孢菌，还分离获得了尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌和藤仓镰孢菌，但未分离到九州镰孢菌，这表明不同玉米栽培方式可能影响玉米茎腐病的镰孢菌类群。

此外，本研究中已分离鉴定的7种镰孢菌中，禾谷镰孢菌的致病性更强。众所周知，禾谷镰孢菌可危害小麦、玉米、大麦等作物，导致穗腐病和茎腐病，也可引起大豆茎基腐和根腐病。在四川、重庆等西南地区，除净作，玉米常与小麦轮作或者与大豆套作，研究发现来源于小麦、玉米和大麦病样的禾谷镰孢菌对玉米的致病性差异并不显著[26-27]，小麦玉米轮作有利于田间病残体及土壤中禾谷镰孢菌的积累，从而加重穗腐病和茎腐病的发生[11，25]。轮枝镰孢菌作为玉米茎腐病的重要致病菌，可在田间病残体、土壤表面或土壤内存活，但对大豆的影响并不大。D.Kendra[28]通过RT-PCR对玉米大豆轮作田中健康大豆植株进行检测发现，大豆体内虽可检测到轮枝镰孢菌，却未影响大豆生长，这就解释了玉米-大豆带状套作下轮枝镰孢菌的分离频率较高，但对玉米的致病性不及禾谷镰孢菌。

综上所述，四川省玉米大豆套作系统下，镰孢菌所引起的玉米茎腐病田间发病率不高，镰孢菌群体与国内其他省份存在差异，但禾谷镰孢菌仍为强致病菌，对于该地区玉米茎腐病的发生具有潜在威胁。同时，玉米大豆带状套作栽培可降低玉米茎腐病的发生，减少化学农药使用量，具有良好的经济效益和生态效益，为本地区玉米生产提供了有价值的参考。