油松枯梢病菌分生孢子器诱导方法探索

暴可心，王雪菲，董亚新，张思涵，崔建州,2，李会平,2

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071000； 2.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

油松Pinustabulaeformis为松科针叶常绿乔木，是非常重要的造林和绿化景观植物，为中国特有树种，广泛分布于我国北方，因其树干挺拔苍劲、四季常绿、枝条开展等优良特点而被选为园林绿化、荒山造林树种[1-3]。近年来，秦皇岛市联峰山的油松枯梢病较为严重，主要表现为油松枝梢丛状枯死、针叶灰白且不脱落，造成树势衰弱，严重时整株死亡[4]。李会平 等[4]已对发生在联峰山的油松枯梢病的病原进行了分离、鉴定，病原菌为球壳孢属真菌Sphaeropsissapinea。该病原菌的分生孢子器为黑色球形，半埋生于松梢表皮层，分生孢子长椭圆形，单胞或多胞，浅棕色，着生在分生孢子器内[3]。对于该病原菌的生物学特性研究、化学或生物药剂的筛选等工作均需要大量的分生孢子器和分生孢子。如何在实验室培养条件下快速获得该病原菌的分生孢子器显得尤为重要。在诱导真菌孢子时，对菌丝进行机械损伤及在菌丝中放置寄主组织段是常用的方法[5]，但通常是放入健康的寄主组织，另外，菌丝在生长过程中经常会覆盖寄主组织，导致分生孢子器不易获取。因此，本研究在利用传统诱导方法的同时，放置已灭菌3次的发病寄主组织段作为对比，在菌丝上放置玻璃纸避免菌丝覆盖寄主组织，并尝试将几种方法进行组合，诱导病原菌快速产生大量分生孢子器，以期为后续的研究提供充足的分生孢子。

1 材料与方法

1.1 材料 油松枯梢病菌分离自秦皇岛联峰山油松枯梢病株的病梢，由河北农业大学林学院林木病理实验室提供。松针采自秦皇岛联峰山公园生长健壮的和发病的2 a生油松。各剪取4 cm段，自来水冲洗，自然风干后，置于培养皿中，加少量蒸馏水保持湿润，121 ℃下高压灭菌25 min，连续灭菌3次备用。

1.2 方法

1.2.1 菌丝培养 用打孔器在马铃薯琼脂培养基(PDA)上培养3 d的油松枯梢病菌边缘打孔取菌块，接种到新的PDA培养基中，在23 ℃、光照12 000 Lx的智能培养箱中培养，直至菌丝长满整个培养皿。

1.2.2 分生孢子器诱导 对长满培养皿的油松枯梢病菌的菌丝分别进行机械损伤(玻璃铲刮平菌丝)、铺玻璃纸(半透性)、放置已灭菌3次的健康或发病寄主松针等8种不同组合处理，诱导产生分生孢子器(表1)。每种处理4个重复，共32皿，每皿放置5根松针。

1.2.3 培养及观察 将经过以上8种处理的油松枯梢病菌菌丝放在23 ℃、光照12 000 Lx的智能培养箱中，逐日观察记录松针上分生孢子器产生情况。分生孢子器的形态和大小用奥林巴斯SZX-16显微镜观察并测量。每种处理随机选取50个分生孢子器进行测量、观察。分生孢子器的成熟度用第10天每种处理下分生孢子器的大小和萌发率表示。萌发率参照李会平 等的方法，分生孢子器作为观察单位，以分生孢子器上及边缘长出白色菌丝作为萌发标准[6]。

1.2.4 数据统计与分析 采用Excel软件和SPSS软件分别整理录入及分析数据，用LSD法(最小显著差法)进行方差分析(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理下分生孢子器的产生情况 不同处理下分生孢子器的产生情况见表1。

表1 不同处理产生分生孢子器的日平均值

自第3天开始，各种处理的松针上开始出现黑色小粒点，即分生孢子器。随着培养时间的延长，分生孢子器数量增逐渐多，形状逐渐变大，球形，半埋生在表皮层，随后逐渐突出表皮外露。但不同处理下分生孢子器产生的时间及数量不同。总体来看，无论是否机械损伤、是否铺玻璃纸，发病松针上产生的分生孢子器均比健康松针上产生的时间早且数量多。无论何种处理，铺玻璃纸后分生孢子器产生的速度降低、数量减少，但试验中明显看到，铺玻璃纸后松针上产生的分生孢子器极为干净，非常方便分生孢子的获取(图1)。菌丝机械损伤后对分生孢子器的产生也有明显的影响，不论何种处理，机械损伤均使分生孢子器产生速度减慢，但随着时间的延长，最终产生分生孢子器的数量差异不明显。

图1 松针上产生的分生孢子器

2.2 不同处理下分生孢子器的成熟情况 随着培养时间的延长，分生孢子器逐渐增大，成熟。培养第10 d时分生孢子器大小和萌发率见表2。

表2 不同处理后第10天时分生孢子器的大小和萌发率

注：同列不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

第10天时，不同处理下产生的分生孢子器成熟情况明显不同。其中，在不铺玻璃纸的菌丝上放置已灭菌3次的发病松针的两个处理(是否机械损伤)间差异不显著，分生孢子器的大小分别为1.423 mm和1.396 mm，萌发率分别为87.1%和85.4%，但均明显高于其他处理。

3 结论与讨论

研究表明，在不铺玻璃纸的菌丝上放置已灭菌3次的发病松针处理后，不论是否机械损伤，均可诱导分生孢子器快速大量产生。但铺玻璃纸更有利于获得干净的分生孢子器。该研究结果可为油松枯梢病病菌的后续研究提供大量的分生孢子器和分生孢子，具有重要的理论和实践意义。

目前，利用植物组织诱导法是室内诱导植物病原菌产孢的主要方法，吴湘琴 等[7]用健康梨树枝条诱导出梨树腐烂病菌分生孢子器；赵红 等[8]研究结果表明，采用灭菌的苹果枝条能诱导出苹果腐烂病菌分生孢子器。本研究亦利用油松松针诱导出大量油松枯梢病的分生孢子。另外，本文分别采用健康松针和发病松针进行诱导产孢，结果表明，以发病松针诱导分生孢子器效果明显优于健康松针，可能是由于发病松针与健康松针相比，营养成分更加贫乏，不利于菌丝的营养生长，而刺激了其繁殖生长。本试验中，为了获得干净的分生孢子器，尝试在长好的菌丝中铺玻璃纸，结果发现铺玻璃纸后会影响松针上分生孢子器的产生，但试验中观察到，在玻璃纸下面培养基上产生了一定数量的分生孢子器。因此，应该是玻璃纸影响了菌丝向松针组织的蔓延，进而影响了分生孢子器的产生。同时，试验中也发现，尽管玻璃纸上的松针上分生孢子器的数量少，但由于没有菌丝在松针上的生长、蔓延，分生孢子器清晰可见、极为干净，非常便于自分生孢子器中获取大量干净的分生孢子。但如何从分生孢子器中快速简便获取分生孢子还有待进一步探索。