补肾化痰祛瘀汤的神经保护作用及其机制探究*

展 昆，周丽娟，刘瑞琦，伍新林，刘嘉辉，黄颖娟

（中山大学附属第一医院，广东 广州 510080）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种慢性、进行性、不可逆的中枢神经系统退行性疾病，主要表现为记忆障碍、认知能力下降和行为能力丧失，严重影响患者的日常生活质量[1]。新近研究发现，外源性神经毒性物质（如常见的不饱和醛类物质、亚硝胺类物质等）可导致大脑持续的氧化应激损害，从而诱发AD或加重AD病情[2-3]。丙烯醛（acrolein，ACR）作为饮食和环境中广泛存在的、最具活性的不饱和醛类物质[4]，被认为和AD的发病密切相关[5]。本课题组前期研究也发现丙烯醛可诱导SD大鼠行为和认知障碍，同时对HT22细胞具有神经毒性作用，能产生和AD类似的病理损害[6]。因此，清除丙烯醛诱发的神经毒性作用可能帮助改善AD病情。

目前认为AD的发病是多因素、多环节的，西医尚缺乏有效的治疗方法来阻止或逆转AD的病程进展，且药物治疗的有效性仍然不能令人满意[7-8]。AD属于中医学“痴呆”的范畴，肾虚为本、痰瘀阻滞为标的基本病机贯穿着AD发生发展的始终[9]，因此近年来关于AD的实验研究和临床治疗均格外侧重对补肾、化痰、祛瘀等治法的应用[10-12]。中药多环节、多途径的整体治疗作用也更契合AD复杂的病理机制。

补肾化痰祛瘀汤是由全国老中医药专家秦鉴教授、金明华、黄颖娟副教授根据临床经验总结而成，在临床治疗AD中取得了较好的效果，但其具体作用机制尚不明确。本实验使用丙烯醛诱导SD大鼠神经毒性模型和HT22海马神经元毒性模型，通过观测补肾化痰祛瘀汤对SD大鼠行为学、海马组织病理学及HT22细胞活力的影响，探究其发挥作用的可能机制，以期为中医药清除丙烯醛神经毒性作用、防治AD提供新的科学依据。

1 材 料

1.1 实验动物6～8周龄SPF级雄性SD大鼠75只，体质量180～220 g，均由中山大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2021-0029。大鼠饲养于12 h昼夜交替SPF级屏障环境独立通气笼中，温度控制在24～26℃、相对湿度45%～55%。大鼠在给予丙烯醛之前适应性饲养1周。本实验获得中山大学实验动物伦理委员会批准，伦理批件号：IACUC-DB-16-0508。

1.2 细胞HT22细胞系由中山大学孙逸仙纪念医院提供。

1.3 药物与试剂 补肾化痰祛瘀汤，方药组成：熟地黄15 g，山萸肉15 g，枸杞子15 g，制何首乌15 g，远志10 g，石菖蒲10 g，川芎10 g，桃仁12 g，丹参12 g。上述中药颗粒均由华润三九医药股份有限公司提供，按照药物比例溶于生理盐水，生药质量浓度为0.362 5 g/mL。盐酸多奈哌齐片（批号：100801053，规格：5 mg/片）购于卫材中国药业有限公司；BDNF抗体（批号：Ab108319）、TrkB抗体（批号：Ab18987）、ADAM10抗体（批号：Ab124695）均购自Abcam公司；APP抗体（批号：2452）、GAPDH抗体（批号：2118）均购自美国CST公司；IgG-HRP标记山羊抗兔二抗（批号：sc-2004）购自SANTA CRUZ公司；DMEM培养基（批号：c11965500）购自GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶（批号：GNM25200）购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清FBS（批号：2916754）购自美国MP公司。

1.4 主要仪器WMT-200型Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）；JJ100型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；XD5-1B型倒置显微镜（德国徕卡公司）；SW-CJ-2FD型双人单面净化超净台（苏州净化设备有限公司）；Mini型蛋白电泳系统（美国伯乐公司）；LG2000型数码凝胶图像分析系统（杭州朗基科学仪器有限公司）；MM-55785-00型CO2恒温培养箱（美国SHELLAB公司）；TGL-18R型冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 体内实验

2.1.1 动物分组、造模和给药 将SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、丙烯醛模型组、中药对照组、中药治疗组（丙烯醛+补肾化痰祛瘀汤）、多奈哌齐治疗组（丙烯醛+多奈哌齐），每组15只。丙烯醛灌胃浓度和前期实验浓度一致[6]，即灌胃剂量为2.5 mg/kg。模型组大鼠每天08:00:00使用丙烯醛灌胃1次，2.5 mg/kg，中药治疗组和多奈哌齐治疗组大鼠在灌胃丙烯醛的同时给予相应的干预措施，根据大鼠与人体体表面积单位换算，补肾化痰祛瘀汤灌胃剂量为8 mL/kg，中药治疗组大鼠每天14:00:00使用补肾化痰祛瘀汤灌胃1次；多奈哌齐治疗组按0.42 mg/kg剂量每天14:00:00灌胃盐酸多奈哌齐片溶液1次，空白对照组和中药对照组大鼠分别采用等体积生理盐水和补肾化痰祛瘀汤灌胃，8 mL/kg，周期为3个月。

2.1.2 Morris水迷宫实验 给药结束后，分别采用定位航行实验和空间探索实验评价大鼠学习能力和空间记忆能力。在整个测试过程中，平台始终置于第三象限，连续4 d，每天对实验动物进行3次训练，第4天撤除安全平台进行空间探索实验。分别记录各组大鼠到达安全平台的时间（即逃避潜伏期）、120 s内穿越原安全平台所在区域的次数（即穿越平台次数）。

2.1.3 HE染色观察大鼠海马病理形态变化 行为学检测后，将大鼠进行麻醉、灌注直至大鼠肢体变得僵硬，冰上取脑并分离完整的海马组织。用于病理切片的鼠脑置于4%多聚甲醛中固定6 h后，浸于30%蔗糖溶液中脱水，至脑组织沉至瓶底后取出，石蜡包埋，制作大鼠海马CA1区4 μm厚的横断面脑切片，脱蜡脱水后置于苏木素染液5～10 min，经蒸馏水冲洗、盐酸乙醇分化后置于伊红染液浸染3～5 min，蒸馏水冲洗后依次脱水和透明，封片拍照。

2.1.4 Western blotting法 检 测 海 马 中BDNF/TrkB、APP及ADAM10的蛋白表达水平BCA试剂盒测定大鼠海马组织蛋白质浓度。按照20 μg蛋白计算上样量，将组织样品裂解液和凝胶上样缓冲液混合。用5%浓缩胶和10%分离胶，SDS-PAGE电泳后取BDNF、TrkB、APP及ADAM10蛋白所在的凝胶条带进行PVDF膜转印。随后浸入5%脱脂牛奶中封闭90 min。将稀释好的一抗均匀覆盖于PDVF膜表面4℃过夜孵育，用TBST洗3次，每次10 min。将稀释好的二抗加入PDVF膜表面室温孵育1 h，用TBST洗涤膜3次，每次5 min。用ECL试剂盒进行显色曝光，使用Bio-Rad化学发光凝胶自动成像系统检测条带。使用Image J分析各样本灰度值。

2.2 体外实验

2.2.1 药物制备与细胞模型制备 将补肾化痰祛瘀汤颗粒制成每毫升含1 g生药的溶液（以上药物共114 g，加至生理盐水中，总容积为114 mL，反复搅拌离心过夜，直至完全溶解），离心后多次过滤除菌，取滤液置于冰箱备用。细胞用时以无血清培养基稀释，过滤除菌。中药终溶液配制方法：如5%中药即95 μL的细胞培养基+5 μL中药溶液。多奈哌齐片溶液制备：将多奈哌齐片碾碎至粉末，用PBS溶解制成1 mmol/L的溶液，多次过滤除菌，取滤液置于冰箱备用，临用前稀释成10 μmol/L浓度。

HT22海马神经元毒性模型的制备：按照课题组前期实验结果[6]，ACR神经损害模型采用25 μmol/L丙烯醛对HT22细胞作用24 h，即得。

2.2.2 细胞培养与药物保护浓度测定 将HT22细胞置于含10%FBS的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。根据半数抑制浓度（IC50）曲线，采取IC50值的1/2、1/4、1/8浓度的中药含药培养基进行细胞实验。将细胞随机分为空白对照组、2%中药组、3%中药组、5%中药组、10%中药组、多奈哌齐组。对照组加入空白培养基，其余组分别采用含相应药物的培养基培养，24 h后，MTT法检测细胞活性，即各组加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后测定各组光密度（OD值），检测波长为570 nm，使用倒置显微镜观察各组细胞形态和数量变化。

2.2.3 MTT法测定与细胞形态学观察 将HT22细胞随机分为空白对照组、模型组、2%中药组、3%中药组、5%中药组、多奈哌齐组，空白对照组和模型组加入空白培养基，给药组采用含相对应浓度的含药培养基培养，预处理1 h后，每组均再加入25 μmol/L丙烯醛，24 h后MTT法检测细胞活性，并在倒置显微镜观察各组细胞形态学变化。

2.2.4 Western blotting法检测相关蛋白及BDNF/TrkB通路抑制剂细胞毒性测定 将HT22细胞分为空白对照组、中药对照组、模型组、中药治疗组和多奈哌齐组，各组细胞Western blotting检测及分析方法同“2.1.4”。将HT22细胞分为模型组、抑制剂组、5%中药组和多奈哌齐组，采用BDNF/TrkB通路抑制剂K252a干预HT22细胞，再予补肾化痰祛瘀汤和多奈哌齐治疗，采用MTT法检测细胞活性，方法同“2.2.3”。

2.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS 26.0软件包进行统计学分析。计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 体内实验结果

3.1.1 各组大鼠行为学比较 与空白对照组比较，丙烯醛模型组大鼠定位航行时间明显延长（P＜0.01），穿越平台次数明显减少（P＜0.01）；与丙烯醛模型组比较，中药治疗组和多奈哌齐治疗组大鼠定位航行时间均明显缩短（P＜0.01），平台穿越次数均明显增加（P＜0.05），且两组大鼠行为学表现相当；中药对照组大鼠定位航行时间和穿越平台次数与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图1）

图1 各组大鼠行为学比较 （±s，n=15）

3.1.2 各组大鼠海马CA1区神经元病理改变 空白对照组大鼠海马CA1区神经元和细胞核形态正常，神经元之间边界清楚，排列整齐；与空白对照组比较，中药对照组大鼠海马CA1区神经元形态无明显改变；而丙烯醛模型组大鼠海马CA1区神经元数量明显减少，排列紊乱，细胞核缩小变形；与丙烯醛模型组比较，中药治疗组和多奈哌齐治疗组大鼠海马CA1区神经元形态均出现明显改善，神经元数量增多，且中药治疗组改善效果更为明显。（见图2）

图2 各组大鼠海马CA1区神经元病理改变 （HE，×400）

3.1.3 各组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表达比较 与空白对照组比较，丙烯醛模型组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.01），APP蛋白相对表达量明显升高（P＜0.01）；与丙烯醛模型组比较，中药治疗组和多奈哌齐治疗组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），APP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。中药对照组大鼠海马组织BDNF、TrKB、ADAM10、APP蛋白相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3～4）

图3 各组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表达Western blotting图

图4 各组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白相对表达量比较 （±s，n=15）

3.2 体外实验结果

3.2.1 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐对HT22细胞活性的影响 与空白对照组比较，2%中药、3%中药、5%中药、10 μmol/L多奈哌齐均可在一定程度上提高细胞存活率，提示其对HT22细胞无明显毒性作用；而10%中药使HT22细胞存活率明显降低（P＜0.01），提示10%中药可能存在细胞毒性，故后续研究不再采用10%中药。（见图5～6）

图5 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预后各组HT22细胞形态图（×200）

图6 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预后各组HT22细胞存活率比较 （±s，n=3）

3.2.2 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐对HT22神经元毒性模型的影响 与模型组比较，5%中药和10 μmol/L多奈哌齐均能显著提高受丙烯醛神经毒性影响的细胞活力（P<0.01），2%中药、3%中药同样能提高丙烯醛影响下的HT22细胞活力（P<0.05），但效果不如5%中药明显，故后续机制研究采用5%补肾化痰祛瘀汤。（见图7～8）

图7 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预神经毒模型后各组HT22细胞形态图 （×200）

图8 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预神经毒模型后各组HT22细胞存活率比较 （±s，n=3）

3.2.3 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐对HT22细胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型组HT22细胞中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.01），APP蛋白相对表达量明显升高（P＜0.01）；中药治疗组和多奈哌齐组HT22细胞中BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），APP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；中药对照组HT22细胞中APP蛋白相对表达量明显低于空白对照组（P＜0.01），BDNF、TrkB、ADAM10蛋白相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图9～10）

图9 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预后各组HT22细胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白表达Western blotting图

图10 补肾化痰祛瘀汤及多奈哌齐干预后各组HT22细胞中BDNF、TrkB、APP、ADAM10蛋白相对表达量比较 （±s，n=5）

3.2.4 补肾化痰祛瘀汤对BDNF/TrKB通路的特异性 与模型组比较，抑制剂组HT22细胞存活率明显降低（P＜0.05），提示K252a可加剧丙烯醛的细胞毒性。5%中药组和多奈哌齐组细胞存活率均明显高于抑制剂组（P＜0.05）。（见图11）

图11 BDNF/TrkB通路抑制剂干预后各组HT22细胞存活率比较 （±s，n=3）

4 讨 论

中医学认为AD的病位在脑，与心、肾、肝、脾相关。AD患者年老体弱，肾虚精亏，髓海不足；同时五脏虚损，精、气、血、津液运行无力，以致痰浊瘀血内生，痰蒙清窍，瘀阻脑窍，神机失用，发为痴呆。所以治疗当以充髓养脑、开郁逐痰、活血通窍为主。补肾化痰祛瘀汤中熟地黄、制何首乌补肾益精，补血填髓；枸杞子、山萸肉滋补肝肾，涩精固脱；石菖蒲、远志共起开窍豁痰、醒神益智、交通心肾之功；川芎、丹参、桃仁活血祛瘀，养血行气；诸药合用共奏补肾化痰祛瘀之功。

AD的病理学特征主要包括β-淀粉样蛋白（Amyloid-beita peptides，Aβ）沉积而形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化所形成的神经元纤维缠结及神经元的变性丢失[13]。本实验结果证实丙烯醛具有神经毒性，不仅可以导致SD大鼠认知功能障碍，引起大鼠海马CA1区神经细胞的丢失，同时丙烯醛能在HT22神经细胞中产生神经毒性，诱发类似AD的病理表现。这与本课题组前期研究结果一致[6]。而补肾化痰祛瘀汤和多奈哌齐均可改善这一病理损害，提高受丙烯醛影响的HT22细胞活力，表明补肾化痰祛瘀汤和多奈哌齐具有相似的神经保护作用。且从海马CA1区神经元损害恢复程度上看，补肾化痰祛瘀汤的改善作用更为明显。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经生长因子家族的重要成员，广泛分布于海马和皮层等区域，对减轻中枢神经系统神经元的损伤、大脑神经元的发育、轴突和树突的生长及突触的可塑性具有十分重要的意义[14-15]。BDNF可与细胞膜上的受体酪氨酸激酶B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）特异性结合，通过磷酸化TrkB受体发挥生物学效应。BDNF/TrkB信号通路与AD的发生发展密切相关[16]，有研究发现AD患者大脑海马和前额皮质中BDNF及TrkB蛋白表达均明显降低[17-18]。本课题组前期研究也发现AD大鼠海马组织中BDNF表达升高能够改善AD的症状，阻断BDNF/TrkB通路可加剧海马神经元损害[19]。本实验研究结果也证实丙烯醛作用后大鼠海马组织和HT22细胞内BDNF/TrkB通路蛋白水平均明显降低，且BDNF/TrkB信号通路抑制剂K252a作用可加重丙烯醛神经毒性，表明丙烯醛可能通过损坏BDNF/TrkB信号通路产生神经毒性作用。而给予补肾化痰祛瘀汤后可明显提升BDNF/TrkB通路蛋白水平，提示补肾化痰祛瘀汤发挥神经保护作用的机制可能是上调BDNF/TrkB信号通路。

淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）作为Aβ的主要来源，在大脑内的过多表达可能会增加AD的发病风险[20]，故降低APP的表达、减少Aβ的沉积仍然是目前AD药物治疗的重要途径[8]。APP在生理条件下可经非淀粉样途径被α内分泌酶分解成不具有神经毒性的可溶性片段sAPPα，而在病理条件下则经淀粉样途径被β、γ内分泌酶剪切成具有神经毒性的Aβ，且两种途径呈竞争性代谢关系，因此去整合素金属蛋白酶10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）作为主要的α内分泌酶在减少Aβ沉积方面具有重要意义[21-22]。本课题组前期临床研究发现，ADAM10的活性升高可以促进APP分解、降低丙烯醛浓度，进而提高AD患者的认知功能[23]。本实验研究结果表明，丙烯醛不仅可以诱导大鼠海马和HT22神经细胞APP的过多表达，同时会降低具有神经保护作用的ADAM10水平，而补肾化痰祛瘀汤治疗后能降低APP在海马组织和HT22神经细胞内的表达，同时能明显提升ADAM10水平，并通过这一途径，最终减少Aβ沉积，表明补肾化痰祛瘀汤发挥神经保护作用的机制可能与增加ADAM10表达、促进APP蛋白分解有关。

综上所述，补肾化痰祛瘀汤可改善外源性丙烯醛诱导的SD大鼠认知功能障碍并减轻海马CA1区神经元损伤，同时降低丙烯醛对HT22细胞的神经毒性，具有神经保护作用，其潜在的作用机制可能为上调BDNF/TrkB信号通路以减轻海马神经元损伤、增加ADAM10表达、促进APP蛋白分解，最终可能通过减少Aβ沉积，帮助改善AD病情。