异泽兰黄素通过降低活性氧效应拮抗新霉素诱发的听觉毛细胞损伤的实验研究

胡兵向登李健陆小婵董洪松聂国辉*

1深圳市第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科（深圳 518025）

2河池市人民医院耳鼻咽喉头颈外科（河池 547099）

氨基糖甙类抗生素是临床上常用的抗革兰阴性菌药物，具有抗菌作用强、广谱、各种环境温度下稳定性好、经济成本低等诸多优势。然而，氨基糖苷类抗生素导致耳毒性的发生率高，能造成永久性的听力下降，伴发眩晕、耳鸣等症状[1,2]。迄今为止，临床上对氨基糖苷类抗生素的耳毒性缺乏有效的治疗药物，更多的措施是减少该类药物的使用剂量和使用频率，尽量降低其耳毒性风险的发生。很多实验研究探索小分子药物干预新霉素耳毒性从而达到保护听觉毛细胞的目标[3]。基础研究表明新霉素耳毒性分子机理与细胞氧化应激及其诱发的细胞凋亡相关，抗氧化剂和抗凋亡剂有望降低新霉素耳毒性[4]。

异泽兰黄素（5,7-dihydroxy-3′,4′,6-trimethoxyflavone，Eupatilin，EUP）是从蒿属植物中分离到的亲脂性黄酮类化合物[5]。由于研究发现EUP具有很好的抗炎作用，以EUP为主要成份的胃黏膜保护药物StillenTM已在韩国等东亚国家被应用于胃炎及胃溃疡的临床治疗[6]。由此可见，EUP具备临床药物的安全性和稳定性等特性。除了抗炎作用以外，EUP还具有明显的抗氧化、抗凋亡及神经保护等药理效应[7]。目前尚没有研究报道EUP在听觉毛细胞损伤中的作用。综合分析EUP的药物特点和效应，本研究提出假说，认为EUP可能具有通过抑制听觉毛细胞氧化应激损伤从而保护毛细胞的作用。

为验证所提出的假说，本研究首先建立了HEI-OC1细胞和斑马鱼实验模型。HEI-OC1细胞(House Ear Institute Organ of Corti l cell)是耳科研究常用的细胞模型，具有耳蜗毛细胞样细胞的特征[8]。转基因斑马鱼(Brn3c：mGFP)的侧线神经丘毛细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），非常利于观察毛细胞的损伤情况，是一个很好的筛选听觉保护药物的模式动物[9,10]。本研究利用HEI-OC1细胞和转基因斑马鱼模式动物，构建新霉素耳毒性模型，进而探索EUP通过拮抗新霉素耳毒性而发挥保护毛细胞的作用和相关机制。

1 资料和方法

1.1 实验动物

野生型斑马鱼和转基因斑马鱼（Brn3c：mGFP）由复旦大学附属眼耳鼻喉医院李华伟教授惠赠。斑马鱼的繁殖、饲养条件、饲养方法均参照《Zebrafish Book》（http://www.zfin.org）进行。所有实验均获得深圳市第二人民医院伦理委员会的审核批准。

1.2 HEI-OC1细胞培养及药物处理

HEI-OC1细胞来自于复旦大学眼耳鼻喉医院李华伟教授实验室惠赠。细胞培养于33℃、5%CO2的培养箱，培养基为高糖DMEM及10%胎牛血清，不含抗生素。细胞常规接种于96孔板，24小时贴壁后，分别给予不同浓度的新霉素和EUP药物处理。

1.3 CCK-8检测细胞存活率

处于对数生长期的HEI-OC1细胞（1×104个）接种于96孔板，经过相应的药物处理后，细胞分为空白对照组，新霉素损伤组和EUP实验组。新霉素溶于纯水，实验浓度梯度为1、5、10、20、40 mM，将各浓度的新霉素处理HEI-OC1细胞24小时后，吸出原培养基，加入含10%CCK-8溶液的新培养基，在37℃孵育2小时，利用酶标仪进行吸光值测定以确定构建毛细胞损伤模型的相应新霉素实验浓度。EUP溶于DMSO，母液浓度为10 mM，实验浓度梯度设置为5、10、20、40、80 μM。各孔的EUP早于新霉素2小时加入培养基中，新霉素加入24小时后，细胞处理完成，此时吸出原培养基，每孔加入含10%CCK-8溶液的新培养基，37℃孵育2小时，同样采用酶标仪测定吸光值。按照CCK-8试剂盒说明，细胞存活率计算方法为：细胞存活率=（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）×100%。采用Graph-prism软件统计分析各实验组的细胞存活率。

1.4 细胞内ROS检测

使用荧光探针DCFH-DA（Molecular Probes，USA）对细胞内ROS水平进行检测。处于对数生长期的细胞以每孔5×104个细胞的密度接种到24孔板中。细胞经EUP和新霉素处理（具体处理方法同1.3所述），吸出原培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，然后在37℃下与DCFH-DA（浓度10mM）避光孵育30分钟，然后立即在黑暗环境下采用荧光显微镜观察细胞。细胞荧光图像用Olympus FV1200荧光显微镜拍摄，ImageJ软件进行图像分析并测算各组细胞的探针荧光强度。

1.5 细胞线粒体荧光染色

处于对数生长期的细胞培养后种板贴壁，经EUP和新霉素分别各项处理（具体处理方法同1.3所述），然后采用Mitotracker Red荧光染料（Thermofisher，USA）进行线粒体荧光染色标记。该红色染料的积累取决于线粒体膜电位的高低，且在细胞固定和透化等步骤后依然维持在细胞内，不会被洗掉。细胞核染色用DAPI孵育15分钟。抗淬灭剂封片。细胞荧光图像用徕卡SP8共聚焦显微镜拍摄，ImageJ软件进行图像分析。

1.6 斑马鱼新霉素损伤模型构建及药物处理

荧光显微镜下观察受精后5天的转基因斑马鱼（Brn3c：mGFP）侧线神经丘毛细胞，挑出毛细胞GFP阳性表达的斑马鱼纯合子构建新霉素损伤模型。挑出的斑马鱼纯合子分为新霉素损伤组、EUP实验组和正常对照组。新霉素损伤组的处理为新霉素溶于饲养鱼水，0.5 mM的新霉素损伤30分钟。EUP实验组的斑马鱼在含有EUP药物的饲养鱼水中4小时后，再加入0.5 mM新霉素，新霉素损伤时间同样为30分钟。正常对照组为无药物处理。

1.7 斑马鱼侧线毛细胞的免疫组化标记和细胞计数

按照1.6所述的药物处理方法，经新霉素和/或EUP药物处理后的斑马鱼置于4%多聚甲醛室温固定2小时；PBS润洗3次，加入封闭液室温封闭1小时；加入一抗，鸡抗 GFP（Life Technologies，1：200）4℃孵育过夜。第二天，经PBS润洗3次，加入二抗室温孵育1小时，再加入DAPI进行细胞核染色15分钟。抗淬灭剂封片后，在徕卡共聚焦显微镜（SP8）观察成像，观察并记录侧线L1-L5神经丘中GFP阳性细胞数目，统计分析各组斑马鱼侧线神经丘GFP阳性毛细胞数量，比较各组平均神经丘GFP阳性毛细胞数量。

1.8 统计学方法

实验数据以平均数±标准差（）表示，采用Student’st检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 EUP显著降低新霉素细胞毒性，提高HEIOC1细胞存活率

在新霉素处理HEI-OC1细胞24小时后，随着新霉素浓度的增加（1，5，10，20，40 mM），CCK-8实验检测HEI-OC1细胞的活性逐渐降低，即是新霉素对HEI-OC1细胞的毒性效应逐渐增加。在新霉素浓度为20 mM的条件下，CCK-8实验检测HEIOC1细胞活性为50%。因此，选取20 mM的新霉素用于构建新霉素耳毒性的细胞模型，进行后续实验。在20mM新霉素损伤条件下，给予不同浓度的EUP预处理可提高HEI-OC1细胞的存活率，最佳效果的浓度为40 μM，而当EUP浓度增加到80 μM时细胞的存活率下降，反而增加了HEI-OC1细胞损伤(图1)。该结果说明过高浓度的EUP对细胞具有毒性作用。因此，本部分实验结果发现一定浓度的EUP可显著抑制新霉素对HEI-OC1细胞的毒性损伤，保护HEI-OC1细胞，但过高浓度的EUP具有潜在的细胞毒性作用(图1)。

图1 CCK-8检测结果显示EUP显著降低新霉素诱发HEIOC1细胞死亡，EUP显著增加HEI-OC1细胞的存活率（vs 0 μM,*：P＜0.05，**：P＜0.01）。Fig.1 CCK-8 results showed EUP significantly reduced the HEI-OC1 cell death induced by neomycin,and the cell viability of HEI-OC1 cells was increased with EUP treatment(other groups vs 0μM group,*：P＜0.05，**：P＜0.01).

2.2 EUP明显降低新霉素诱发的细胞内ROS水平

DCFH-DA探针是一种可渗透细胞的，用于检测细胞内活性氧(ROS)的探针。本研究检测结果显示HEI-OC1细胞内DCFH-DA的强度在20mM新霉素作用24h后比正常对照组显著升高，而EUP（40 μM）处理后细胞的DCFH-DA强度与对照组无差异，表明新霉素可显著诱发HEI-OC1细胞内ROS产物，一定浓度的EUP对细胞内ROS无明显影响。当EUP和新霉素共同作用HEI-OC1细胞时，细胞内DCFH-DA荧光强度与新霉素损伤组相比显著降低，表明EUP可显著抑制新霉素导致的细胞内ROS增多（图2）。

图2 ROS探针检测显示EUP显著降低新霉素诱发HEIOC1细胞的ROS增多（**：P＜0.01）。A为对照组（Con），B为新霉素损伤组（neo），C为EUP单独作用组（Eup），D为新霉素和EUP共同作用组（neo+Eup）。Fig.2 The ROS probe tests showed that EUP significantly inhibit the ROS product induced by neomycin in HEI-OC1 cells（**：P＜0.01）.Noted:A for control group,B for only neomycin group,C for only EUP group,D for neomycin plus EUP group.

2.3 EUP显著降低新霉素诱发的线粒体损伤

采用MitoTrack Red红色荧光染料去标记细胞线粒体。实验结果发现HEI-OC1细胞在新霉素作用后与正常对照组相比，细胞内标记线粒体的红色荧光显著减少，红色荧光标记在细胞核周围分布不均，细胞核形态也不规则，说明新霉素显著损伤HEI-OC1细胞的线粒体（图3）。当EUP（40 μM）和新霉素共同作用HEI-OC1细胞时，与新霉素损伤组相比较，细胞内标记线粒体的红色荧光显著增多，说明EUP药物干预后细胞内活的线粒体更多，线粒体活性得到了保护，显著抑制新霉素对HEIOC1细胞线粒体的损伤（图3）。

图3 Mitotracker Red标记线粒体显示EUP显著降低新霉素对HEI-OC1细胞线粒体的损伤。Fig.3 The Mitotracker Red probe tests showed EUP mainly decreased the damage of mitochondria induced by neomycin in HEI-OC1 cells.

2.4 EUP明显降低新霉素对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的损伤

本研究利用转基因斑马鱼(Brn3c：mGFP)构建新霉素损伤模型。斑马鱼侧线神经丘毛细胞的免疫荧光染色结果显示新霉素作用后侧线毛细胞的数量较正常对照组显著减少，两组相比有显著性差异（t=22.78，P＜0.01）；新霉素导致毛细胞结构破坏，纤毛消失（图4）。当EUP（60 μM）和新霉素共同处理斑马鱼时，与新霉素损伤时相比较，EUP药物干预组的斑马鱼侧线神经丘毛细胞的数量显著增多，两组相比有显著性差异（t=12.43，P＜0.01），说明毛细胞的形态和数量均得到了保护（图4）。斑马鱼实验结果表明EUP可抑制新霉素对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的损伤作用。

图4 斑马鱼实验结果显示EUP显著降低新霉素对侧线神经丘毛细胞的损伤（**：P＜0.01）。,每组均10条斑马鱼侧线神经丘（Neuromast,NM）（n=10）。Fig.4 The results of zebrafish model showed that EUP significantly inhibit the hair cell loss induced by neomycin in the neuromast of zebrafish lateral line（**：P＜0.01）.Noted:n=10 fishes in each group.

3 讨论

胃黏膜保护药StillenTM（DA-9601的商品名）是一种安全、有效、耐受性好的治疗胃炎的临床药物，在韩国等东亚国家普遍应用于消化系统疾病治疗[7]。StillenTM中的主要成分是异泽兰黄素（Eupatilin，EUP）。很多研究表明EUP是一个新型的抗氧化剂，能够阻断H2O2诱发的过氧化物反应，显著抑制硫酸亚铁诱导的活性氧（ROS）合成[11]；EUP明显降低细胞内一氧化氮合酶(NOS)活性，抑制氧化应激，同时可增加HSP70和Bcl-2的表达水平[12]。除此之外，EUP还具有抗凋亡、抗炎、神经保护等作用。研究发现EUP能保护脑缺血性疾病中的海马CA1区神经元细胞，还可以通过抑制NF-κB信号通路降低小胶质细胞活化而发挥神经保护作用[13,14]。有研究发现EUP通过降低磷酸化JNK蛋白和p38蛋白的表达发挥抗凋亡作用而抑制药物引起的肾上皮细胞损伤[15]。

本研究通过体内和体外实验揭示EUP对新霉素诱导的听觉毛细胞损伤具有拮抗作用，可以降低新霉素的耳毒性。首先在CCK8实验中发现EUP对新霉素诱导的HEI-OC1细胞毒性具有拮抗作用，EUP能明显提高HEI-OC1细胞的存活率。然后本研究开展了斑马鱼体内实验，采用的转基因斑马鱼(Brn3c：mGFP)，其侧线毛细胞表达绿色荧光蛋白，可直接在荧光显微镜下动态观察侧线毛细胞形态并计数侧线毛细胞数量。本研究利用转基因斑马鱼(Brn3c：mGFP)验证EUP对新霉素毛细胞毒性的拮抗作用，发现EUP可以保护斑马鱼侧线神经丘毛细胞。结合多个实验的结果，本研究首次报道EUP具有拮抗新霉素耳毒性的作用，可能是一种新的听觉毛细胞保护药物。

新霉素诱导的听觉毛细胞损伤与细胞内ROS增多，以及线粒体功能异常引起的线粒体膜电位下降紧密相关[16,17]。以往研究发现新霉素诱发细胞内ROS增多，破坏线粒体蛋白的正常合成，降低线粒体膜电位，导致线粒体通透性增加，引起线粒体损伤[16,17]。本研究同样发现在新霉素作用下HEIOC1细胞内ROS显著升高；而EUP作为一种强效抗氧化剂，明显降低新霉素诱发的ROS升高。此外，本研究采用MitoTracker Red荧光染料，一种活细胞应用的可渗透性的X-rosamine衍生物，只需简单孵育就直接聚集在活性线粒体上，聚集的多少取决于线粒体膜电位的高低[19]。本研究结果发现新霉素损伤后HEI-OC1细胞MitoTracker Red染料聚集减少，红色荧光分布不均，只在细胞质的某处显示；而EUP干预作用后明显增加HEI-OC1细胞Mito-Tracker Red染料的聚集明显增加，红色荧光分布更多，说明EUP药物干预后细胞内活的线粒体更多，线粒体膜电位得到了维持和保护[20]，这也可能是EUP能够拮抗新霉素毒性而保护听觉毛细胞的主要原因之一。

综上所述，本研究第一次报道EUP，一种已经临床应用的小分子药物，具有拮抗新霉素耳毒性的作用。本研究发现EUP抑制毛细胞氧化应激，保护毛细胞线粒体，提示其拮抗新霉素耳毒性作用与它的抗氧化效应相关。因此，本研究的意义是首次发现EUP的抗耳毒性作用。关于EUP保护听觉毛细胞的分子调控机制，有待于进一步的探索和研究。