硫酸新霉素的研究*

胡永彬，徐礼生

(1 新宇药业股有限公司，安徽 宿州 234000；2 宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

1 硫酸新霉素的性质

从弗氏链霉菌的发酵产物中分离得到的新酶素，是最早被发现的2-脱氧链酶胺氨基糖苷类抗生素[1]，具有抗菌能力强特点[2]。氨基糖苷类抗生素的产生菌对磷酸盐极为敏感，仅在亚最适生长磷酸盐的浓度时产量最高[3]. 氨基糖苷类抗生素产生菌被某些金属离子如Ca、Cu、My、Na、Zn等刺激而产生抗生素[4]。新霉素是碱性水溶性抗生素，可在实际应用过程中，中和酸性物质，结合成盐，所以工业用新霉素都是硫酸新霉素物质。硫酸新霉素为白色粉末，不溶于有机溶媒，在pH 2～9的范围内抗菌效能稳定，与酸一起加热即失去大部分活力。硫酸新酶素能够与细菌核糖体30S亚基结合，使mRNA错读，进而抑制翻译过程，抑制细菌蛋白质的合成。因此对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、结核杆菌等发挥良好的抗菌作用，对放线菌、钩端螺旋体、阿米巴原虫有抑制作用，在碱性溶液中抗菌作用较强，是一种理想杀菌剂。硫酸新霉素可阻碍内皮生长因子来干扰血管的形成[2]。氨基糖苷类药物具有一定神经毒性，新霉素的毒性也较大。长期使用硫酸新霉素会伤害第VIII对脑神经，从而引起不可逆性耳聋[5]。也可造成对维生素A、维生素B12的吸收不良等症状[6]。

2 硫酸新霉素的作用机理

新霉素(neomycin，Nm)是弗氏链霉菌产物中纯化得到的一种氨基糖苷类抗生素。其主要作用方式为与细菌核糖体16S rRNA结合，通过诱导密码子误读和干扰起始和易位来抑制蛋白质合成，从而导致细菌死亡[7-9]。硫酸新霉素可损害第8对脑神经、前庭神经和耳蜗神经，导致失去平衡、姿势异常，甚至可造成不可恢复性失聪[10]。硫酸新霉素在肾脏中以原形代谢，可累积在肾脏并损害肾小管上皮细胞，造成一定的肾毒性，根据临床表现程度不同，可分为急性肾功能衰竭和无症状的轻度血清生化指标异常[11]硫酸新霉素可蓄积在毛细胞的线粒体上，并与其膜上的rRNA结合，损坏线粒体膜及其功能，线粒体膜的能量供应被阻断，细胞得不到充分的能量供应而死亡；并且储存在膜内间隙的细胞色素C被释放到细胞质中，并与其他蛋白质结合，形成启动caspase-9激活复合体，活性的caspase-9以正反馈放大效应在细胞内激活非活性的caspase-9和caspase-3，使得细胞的凋亡程序被启动，引起细胞凋亡[12]。新霉素与TAR的小沟结合，使TAR的构象发生变化，缩小了Tat在大沟中的结合区域，抑制Tat与TAR结合，新霉素通过与内部环的结合，从而抑制Rev与病毒RNA结合[13]。新酶胺核心能够与TAR、RRT发生相互作用，使得新霉素与HIV、TAR及RRE、RNA牢固结合，通过质谱分析和凝胶法试验，TAR、RNA中有多个新霉素结合位点[14]。PDGF、VEGF和血管生成素是三种重要的血管发生因子，能够在脑胶质瘤中高效表达[15]，新霉素能够抑制这三种血管发生因子的表达，并抑制脑胶质瘤细胞的增殖，心血管是脑胶质瘤生长所必需的，所以，新霉素不仅可以阻碍心血管的发生，还能够直接抑制脑胶质瘤细胞的增殖。因此，新霉素抗肿瘤的作用将会比单纯抑制肿瘤血管发生或细胞增殖的抑制剂的作用更显著[14]。

3 硫酸新霉素的应用

根据发酵过程特性、发酵动力学的研究结果和淀粉酶活力变化规律，采用发酵过程优化策略，发酵120 h，放罐效价提高，残糖浓度从3.0%下降到1.5%以下，淀粉单耗下降，同时减少排放COD量，达到“减污”、“增效”的目的[16]。采用化学诱变剂亚硝基胍(NTG)进行诱变处理，使孢子发生DNA高频率突变[17]，能够为工业化高效发酵生产新霉素提供优良菌种。针对提高新霉素产素率，可以采用不改变原菌种遗传性状(DNA)，除去摇床发酵原培养基中玉米浆等添加促进剂，同时调节培养基pH，36e培养，缩短摇床发酵周期，新霉素产量提高40%以上[18]。利用花生粕取代花生饼作为硫酸新霉素发酵的原料，避免发酵异常、菌丝畸形等，有效保障发酵生产。采用高效分离手段，如离子交换技术和膜分离技术，优化新霉素发酵液的提取工艺，利用732树脂动态吸附与洗脱，使优化后的硫酸新霉素的提取率达88.2%，降低环境污染[19]。基于多孔板发酵及酶标仪检测高通量选育模型，建立酶标仪测定发酵液中硫酸新霉素的方法，并对24孔板发酵条件进行单因素和正交优化，使硫酸新霉素的效价较原发酵条件有所提高[20]，能够快速筛选诱变后硫酸新霉素高产菌株。建立HPLC法，以金黄色葡萄球菌作为实验菌株，采用抗生素微生物检定法中管碟法中的二计量法测定硫酸新霉素的效价[21]。因硫酸新霉素质子化而带正电荷，可通过静电引力作用与带负电荷的锌试剂阴离子结合成离子缔合物，建立锌试剂共振散射谱新方法，用于实际样品中硫酸新霉素含量的测定[22]。硫酸新霉素可阻遏奥尼罗非鱼的嗜水气单胞菌病，并且，由硫酸新霉素引起的淡水鱼类出血性疾病的病原体，可被良好的控制和杀灭，因此促进禽畜生长[23]。通过正己烷溶解曲安奈德新霉素贴膏，采用水萃取的方法提取贴膏剂中的硫酸新霉素，建立HPLC法测定其含量[24]。针对硫酸新霉素化合物的特殊性，建立通用性强、灵敏度高的液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)测定饲料中硫酸新霉素含量，经磷酸盐缓冲液提取，用C18固相净化、进行高效液相色谱—串联质谱仪测定[25]提高饲料利用率，促进禽畜生长，广泛用于畜牧业。HPLC-PDA法可同时测定硫酸新霉素可溶粉中非法添加甲硝唑、水杨酸、乙酰甲喹、甲氧苄啶，用乙醇提取，经C18柱分离，磷酸盐缓冲液作为流动相洗脱，并采用二极管阵列检测器进行全波长扫描，结果表明，这四种化学药物在0.01～0.12 mg/mL范围内线性关系良好，回收率在98.0%～99.9%之间，能够为兽药市场提供一定的技术支撑[26]。对发酵液中新霉素B组分的含量进行测定，可采用高效液相-脉冲安培检测法，能够有效跟踪发酵过程，为发酵过程中补料、换罐等操作提供依据[27]。通过研究新霉素A、B及其衍生物的作用机理，从而为研制高效、低毒的抗HIV药物提供更多的研究方向和借鉴方法。新霉素在弗氏链霉菌合成途径如下：2-脱氧青蟹肌醇糖合成酶(由neoC基因编码调控)以D-葡萄糖磷酸(G6P)为原料，对其进行催化反应生成2-脱氧青蟹肌醇糖(2DOI)，谷氨酰胺在2DOI转氨酶(由neoS基因编码调控)作用下被转化为2-脱氧青蟹肌醇糖胺(2DOIA)[10]。2DOIA被NAD依赖性脱氢酶(由neoE基因编码调控)催化， C-1位发生脱氢形成3-氨基-2，3-脱氧青蟹肌糖。3-氨基-2，3-脱氧青蟹肌糖被2DOI转氨酶(由neoS基因编码调控)催化转化为2-脱氧链霉胺(2DOS，这类抗生素合成过程中重要中间产物)。2DOS在糖基转移酶(由neoM基因编码调控)与糖基供体(尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡萄糖)作用下发生糖基化反应形成2-氨基-乙酰巴龙霉胺，后者在脱乙酰酶(由neoD基因编码调控)的催化作用下进一步脱去2-N-乙酰基最终反应生成巴龙霉胺[11]。巴龙霉胺的C-6′由neoQ基因编码调控的催化下发生氧化，经过转氨酶(由neoB基因编码调控)催化生成新霉素A(Neamine)。在糖基转移酶(由neoF基因编码调控)的作用下，核糖霉素发生糖基化，随后在脱乙酰酶(由neoD基因编码调控)的催化下生成新霉素Y2。新霉素Y2在FAD依赖性脱氢酶(由neoQ基因编码调控)和转氨酶(由neoB基因编码调控)催化作用下生成新霉素C(neomycin C)。新霉素C在差向异构酶(由neoN基因编码调控)催化作用下C-5‴发生差向异构化形成新霉素B。

4 结 语

抗生素是由微生物及其他有生命的体系所产生的，具有抑制和杀灭其他微生物及抗癌能力的化合物。采用NTG诱变与链霉素抗性突变株筛选新霉素高产菌株，获得Streptomyces fradiae Str63高产突变菌株，奠定了工业化生产新霉素的基础。新霉素的传统生产工艺产率低，排污量大，采用发酵过程优化策略，减少环境污染，提高效价。优化后的新霉素发酵液提取工艺不仅提取率高，节省水资源，而且污染物排放量少，是一种环境友好的提取工艺。可采用微生物法、免疫分析法、色谱法、分光光度法、荧光分析法、电化学分析法、共振散射光谱法和比色法等测定硫酸新霉素。硫酸新霉素在碱性溶液中抗菌作用较强，对于相当多的抗生素都有很见效的作用，能够发展为抗癌、抗HIV、抗肿瘤药物等。硫酸新霉素的微生物发酵生产过程需要继续进一步研究，对菌株进行优化改造，硫酸新霉素的作用机理需要更深入的探究，但随着新霉素的研究不断深入，未来会逐渐解决有关硫酸新霉素的工业应用的难题。