芦丁对全氟辛酸所致的小鼠脂代谢紊乱及肾脏损伤的改善作用▲

王广胤 孙伟强 马新壮 王 力,

(1 蚌埠医学院公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，安徽省蚌埠市 233030；2 慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233030)

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是一种应用广泛的全氟类化合物，由于PFOA具有稳定的C-F键，故其具有极高的热稳定性和化学稳定性。PFOA是一种常见的表面活性剂，存在于不粘炊具的金属涂层，以及纺织品、纸张、清洁和个人护理产品(如洗发水、牙线)等的表面涂层中[1]，PFOA释放到环境中能够抵抗物理或化学机制的降解，对环境造成持续和广泛的污染[2-3]。人们可通过使用含PFOA产品或摄入受污染的水和食物接触到PFOA。研究表明，PFOA在机体中难以代谢排出，经肠肝循环吸收后，主要分布到肾脏和肝脏[4]。PFOA暴露会对多种器官造成损伤，可能与PFOA抑制脂质转运、炎症和免疫相关基因的表达有关[5]。类黄酮是一类分子量较低的多酚类植物化学物质，芦丁属于典型的类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、预防和治疗心脑血管疾病等药理作用[6-8]。芦丁属于维生素P，主要存在于日常食用的蔬菜、水果和中草药，其以各种形式被用于食品制造，例如着色剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、紫外线吸收剂等，同时也是用于制作药物、化妆品、化学工业用品及动物饲料的活性成分[9]。已有研究表明，芦丁可通过减轻氧化应激和修复肾小管损伤来改善肾功能[10]，对糖尿病肾病[11]、缺血再灌注肾损伤[12]及药物性肾损害[13]等具有显著的改善作用。本研究探讨芦丁对PFOA诱导的小鼠肾脏损伤的保护作用，为芦丁的药用研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 芦丁(纯度≥98%)购自北京百灵威科技有限公司(批号：153-18-4)；PFOA(纯度≥98%)购自Sigma-Aldrich公司(批号：335-67-1)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒(微孔法,批号：20200706)、总胆固醇测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法，批号：20210120T)、三酰甘油测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法，批号：20210118)、HDL-C测定试剂盒(批号：20210123)、LDL-C测定试剂盒(批号：20210119)、尿素测定试剂盒(批号：20210125)、肌酐测定试剂盒(20210108)等均购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。ME203E/02型电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，KZ-Ⅱ型高通量组织研磨仪购自Servicebio公司，Synergy2型酶标仪购自BioTek公司，KDC-160HR型高速冷冻离心机购自科大创新公司，Chemray 800型全自动生化分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.2 动物分组与干预方法 雄性ICR小鼠15只，鼠龄4～6周，初始体重为(25±5)g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场[动物合格证号：SCK(豫)2019-0003]。将小鼠饲养于干净的笼子中，温度适宜，光照/黑暗时间为12 h/12 h，自由获取水和标准动物饲料。适应性喂养1周后，采用随机数字表法将15只小鼠分为对照组、PFOA组、PFOA+芦丁组，每组5只。对照组：每日上午9时称重后，按5 mL/(kg·d)给予灌胃ddH2O，1次/d。PFOA组：每日上午9时称重后，按20 mg/(kg·d)给予灌胃PFOA溶液，灌胃体积为5 mL/(kg·d)，1次/d。PFOA+芦丁组：每日上午9时称重后，按20 mg/(kg·d)给予灌胃PFOA溶液，灌胃体积 5 mL/(kg·d)，1次/d；每日下午3时按20 mg/(kg·d)给予灌胃芦丁溶液，灌胃体积5 mL/(kg·d)，1次/d。3组均连续灌胃处理14 d，实验期间每天在相同时间点记录小鼠的体重及基础生命体征。

1.3 标本制备 小鼠连续给药处理14 d后称重并记录，穿刺眼眶静脉采血0.5～1.0 mL，室温下以3 500 r/min离心15 min获取血清，4 ℃下储存待检；采血后采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥离两侧肾脏，4%多聚甲醛固定肾组织24 h。

1.4 组织病理学观察 (1)通过HE染色观察肾脏结构。取部分肾脏组织，经脱水后石蜡包埋，以5 μm厚度连续切片，进行常规HE染色，中性树胶封片，于光学显微镜下观察肾组织病理变化。(2)通过基底膜过碘酸六胺银(periodic acid-silver metheramine，PASM)染色观察肾小球毛细血管基膜、红细胞和细胞核的分布和病变程度。取部分肾脏组织，经脱水后石蜡包埋，以5 μm厚度连续切片，切片脱蜡至水，0.5%高碘酸氧化液浸泡20 min，蒸馏水洗涤，室温下浸入六胺银工作液中1.5～2 h，蒸馏水洗涤后依次用氯化金、核固红、马休黄染色，温箱烤干，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察并拍照。

1.5 血清生化指标的检测 严格按试剂盒操作要求，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清三酰甘油、总胆固醇、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酐水平及LDH活性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，重复测量数据采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠的体重变化 3组小鼠的体重比较，差异有统计学意义(F组间=21.746，P组间<0.001)，3组的体重均无随时间变化的趋势(F时间=2.210，P时间=0.132)，分组与时间有交互效应(F交互=10.574，P交互<0.001)。从干预第6天开始，PFOA组和PFOA+芦丁组小鼠的体重均低于对照组(均P<0.05)，而PFOA组与PFOA+芦丁组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 干预期间3组小鼠体重的变化情况(x±s,g)

2.2 3组小鼠肾脏组织的HE染色结果 HE染色结果提示，对照组小鼠的肾小球外形规则饱满，形态正常，毛细血管袢薄而清晰，肾小囊边界清晰，系膜细胞和内皮细胞正常，肾小管和收集管形态正常，未见肾小球硬化、肾间质炎症反应和纤维化；与对照组相比，PFOA组小鼠肾脏出现明显的结构性损伤，肾小球体积增大，系膜细胞和内皮细胞增生，肾小管上皮细胞水肿、脱落，出现轻度空泡样变性；而与PFOA组相比，PFOA+芦丁组小鼠肾脏组织的结构性损伤明显减轻。见图1。

图1 3组小鼠肾脏组织的HE染色结果(皮质，×1000；髓质，×400)

2.3 3组小鼠肾脏组织的PASM染色结果 PASM染色结果提示，对照组小鼠的肾皮质、髓质分界清晰，肾小管基底膜形态正常，无增厚、皱缩，肾间质清晰；与对照组相比，PFOA组小鼠的肾皮质、髓质分界较清晰，肾小球系膜增厚，肾小球基底膜增厚，肾小管基底膜增厚、皱缩，近端小管刷状缘消失；而与PFOA组相比，PFOA+芦丁组小鼠的肾脏基底膜损伤情况明显减轻。见图2。

图2 3组小鼠肾脏组织的PASM染色结果(×400)

2.4 3组小鼠血清三酰甘油、总胆固醇、HDL-C、LDL-C水平的比较 3组小鼠的血清总胆固醇、LDL-C水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中，PFOA组的血清总胆固醇、LDL-C水平均高于对照组，PFOA+芦丁组的血清总胆固醇、LDL-C水平均低于PFOA组(均P<0.05)，而PFOA+芦丁组与对照组的血清总胆固醇、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。3组小鼠的血清三酰甘油、HDL-C水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 3组小鼠血清三酰甘油、总胆固醇、HDL-C、LDL-C水平的比较(x±s,mmol/L)

2.5 3组小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比较 3组小鼠的血清尿酸、肌酐水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中，PFOA 组血清尿素水平高于对照组，血清肌酐水平低于对照组，而PFOA+芦丁组血清尿素水平低于PFOA组，血清肌酐水平高于PFOA组(均P<0.05)。3组小鼠的血清LDH活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比较(x±s)

3 讨 论

流行病学研究表明，肾脏疾病与环境污染物暴露程度有关[14]。近年来，多项研究表明PFOA与肾脏功能障碍、肾脏组织学改变之间存在关联性[15-16]。有学者报告，PFOA暴露易造成小鼠的肾脏损伤，主要表现在体重及肾脏组织形态学变化等方面[5]。本研究结果显示，PFOA暴露可造成小鼠肾脏损伤，表现为小鼠血清尿素水平升高，以及肾脏发生显著病理学改变，如肾小球体积增大、系膜细胞和内细胞增生、肾小管上皮细胞水肿、脱落纤维结构紊乱等；且PFOA暴露可诱导肾脏脂质代谢异常，表现为血清总胆固醇、LDL-C水平升高，与既往文献报告的结果[17-18]相似。同时，PFOA暴露可导致小鼠体重降低，这可能与其造成脂质代谢紊乱有关。血清肌酐是广泛用于评估肾功能的标志物之一，但血清肌酐浓度易受年龄、性别、肌肉质量和饮食等诸多非肾脏因素的影响[19]。本研究中，PFOA组小鼠的血清肌酐水平降低，与临床上肾功能损伤可导致血清肌酐水平升高的现象不一致，原因可能是PFOA影响能量代谢平衡造成糖、脂质和蛋白质代谢紊乱，导致肌肉萎缩、质量下降，最终导致血清肌酐水平降低[20]，但具体的原因仍需进一步研究明确。

临床研究表明，芦丁具有抗炎、抗氧化、降低血清胆固醇水平、抑制血小板聚集等多方面作用[21-23]。Qu等[24]采用芦丁干预万古霉素所致的肾脏损伤小鼠模型，发现芦丁对小鼠肾脏损伤具有改善作用，可减轻万古霉素诱导的氧化应激、炎症和细胞凋亡；Rakshit等[25]研究发现，芦丁可显著降低肾组织中三酰甘油和胆固醇水平；Chen等[26]研究报告，芦丁可增加高尿酸血症小鼠24 h肌酐的排泄，降低其血清肌酐和尿素氮水平，发挥改善肾功能的作用。本研究结果显示，与PFOA组相比，PFOA+芦丁组小鼠肾脏组织的结构性损伤和肾脏基底膜损伤明显减轻，血清总胆固醇、LDL-C、尿素水平均降低(均P<0.05)。这提示芦丁对PFOA所致的小鼠肾脏结构和功能的损伤均有明显的改善作用，其机制可能与芦丁参与调节脂质代谢，以及通过调节肾脏有机离子转运蛋白发挥其降尿酸作用有关[27]。值得注意的是，本研究中PFOA+芦丁组小鼠同样出现体重降低的现象，这可能与芦丁具有减轻体重、调节脂质代谢的作用[28]有关。

综上所述，芦丁可改善PFOA造成的小鼠肾脏病理学变化和肾功能损伤，对小鼠肾脏具有一定的保护作用，并有助于调节其脂质代谢。