加味苏连温胆汤治疗终末期肾病作用机制的生物信息学研究▲

马思佳 范 娇 潘知玉 张紫嫣 薛舜暄 张 昱

(中国中医科学院西苑医院肾病科，北京市 100091)

在全球范围内，肾脏疾病尤其是终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的患者数量增加，严重威胁着人类的健康，并给社会带来巨大的经济负担[1]。虽然目前已有一些治疗方法可以有效地延缓早期ESRD的进展，但很难延缓晚期ESRD患者的疾病进程[2]。不论是接受血液透析还是肾脏移植，ESRD患者都需要承受巨大的心理和生理压力，早期ESRD患者可无明显不适，但随着肾功能的进行性下降，毒素在体内进一步蓄积，患者可出现恶心、呕吐、纳差、皮肤瘙痒、水肿等表现，并出现认知障碍等一系列并发症[3]。

ESRD在中医学中属“关格”“癃闭”“虚劳”等范畴，病因病机较为冗杂，多属虚中夹实，最后进展为阴阳两虚、脏腑气血受损。肾位于人体下焦，内蕴元阴元阳，是先天之本。《素问·水热穴论》云“肾何以能聚水而生病？岐伯曰：肾者胃之关也，关闭不利，故聚水而从其类也”。饮食水谷入于胃，胃受纳之，其中糟粕的部分皆由肾蒸腾气化而转输膀胱，排出体外。肾居于下焦，内蕴真阴真阳；胃为水谷之海，主腐熟水谷。若肾阳虚弱，元阳亏损，则命门火衰，肾气化生乏源，肾气不足则不能推动水液运行，水液停聚，发为水肿。胃在中焦，其气主降，水液停聚于内，水道不利，则胃气运行受阻，不得其降，必夹肾之聚水而上逆于胃，发为呕吐[4]。脾胃运化失职，升降失司，不能斡旋中焦，则恶心纳差。湿浊毒邪犯溢肌肤，则皮肤瘙痒。临床研究结果表明，应用中医药疗法干预ESRD，在提高透析效果、缓解透析相关症状、改善患者的生活质量、降低医疗费用等方面都具有非常重要的作用[5]。

加味苏连温胆汤主要化裁于苏叶黄连汤与温胆汤，由苏叶、黄连、半夏、萆薢、红花等药物组成，临床随证加减。方中苏叶性辛、温，归肺、脾经，其气辛温能散，气薄能通，上走入肺，中走脾胃，外透于肌表，一药三功，辛、温、行、散并用。肺主气，司清肃，对调整气化枢机起主导作用，气机调达，则升降自如，胃气乃和。黄连性寒、味苦，《神农本草经》曰“黄连主热气”。凡药能去湿者必增热，能除热者必不能去湿，唯黄连能以苦燥湿，以寒除热，一举而两得[6]。又因黄连味苦坚阴，可厚肠胃，有一定的止泻作用。半夏燥湿化痰的同时可以和胃，与萆薢合用宣化湿浊，开通郁结；血不利则为水，湿浊毒邪充斥三焦，气滞则水停血瘀，血瘀又会进一步加重水肿，瘀血不去，新血难生，故佐以红花活血化瘀。诸药合用，共奏理气活血、通腑泻浊之功，可以改善ESRD患者的临床症状，减轻服用激素的副作用并延长患者进入透析的时间。

GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中收录了众多生物医学的基因数据，内含多种疾病的原始基因表达数据集和平台操作记录，而网络药理学可以预测药物活性成分的生物靶点[7]，二者结合可以从整体上分析加味苏连温胆汤治疗ESRD的潜在作用机制，可为临床上应用加味苏连温胆汤治疗ESRD提供参考。

1 材料与方法

1.1 加味苏连温胆汤活性成分的筛选 将加味苏连温胆汤中的苏叶、黄连、半夏、萆薢、红花5种药物成分，分别输入中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中进行成分检索[8]，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%、药物相似性(drug-likeness，DL)值≥0.18作为条件筛选出加味苏连温胆汤的活性成分，物种限定为 “Homo sapiens”。

1.2 加味苏连温胆汤活性成分潜在作用靶点的获取 利用TCMSP数据库获取加味苏连温胆汤活性成分的潜在作用靶点，借助UniProt数据库(http://www.uniprot.org)除去没有相应靶点的活性成分，然后应用Perl软件(V5.24.1)为筛选出的靶点添加基因名并规范靶点的基因名。

1.3 ESRD组织与正常肾脏组织差异基因的获取 根据样本量及相关条件(样本量≥20，选择芯片的表达数据阵，选择物种为人)，在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中选取与ESRD有关的芯片GSE37171，下载相关平台的数据后，利用R语言软件(V3.6.2)设定筛选条件为P值<0.05、|log2FC|>1，得到ESRD组织与正常肾脏组织的差异基因(简称ESRD差异基因)文件“diff”，然后运用R语言软件中的pheatmap包，分别筛选出上调与下调最显著的20个基因，绘制ESRD差异基因的热图，运用R语言软件中的plot包绘制火山图。

1.4 药物靶点与ESRD差异基因的韦恩图的绘制 利用R语言软件(V3.6.2)对加味苏连温胆汤活性成分的潜在作用靶点与ESRD差异基因取交集，得到的交集基因即为加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点，将映射结果以韦恩图的形式展示。

1.5 加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点的调控网络和拓扑分析 将1.4中的交集基因导入到CytoScape 3.7.0软件中，构建活性成分-疾病靶点调控网络图。使用Bisogenet和CytoNCA两个插件，构建交集基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，对交集基因设置相应参数[度中心度(degree centrality，DC)>61，中间中心度(betweenness centrality，BC)>600)]构建相应的拓扑网络，筛选出度值最高的基因为核心作用靶点。

1.6 功能和通路富集分析 采用R语言软件(V3.6.2)的“ggplot”和“clusterProfiler”包对得到的交集基因进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析(包括细胞组分、分子功能、生物过程)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05 为差异有统计学意义，绘制相应的柱状图和气泡图。

2 结 果

2.1 加味苏连温胆汤的活性成分及其潜在作用靶点 共筛选得到加味苏连温胆汤的活性成分2 763个，其中槲皮素为红花、黄连共有的有效成分，黄芩苷元为半夏、红花共有的有效成分。获得有效活性成分的潜在作用靶点共457个。

2.2 ESRD差异基因 从GEO数据库下载GSE37171芯片及平台数据，共获得115个样本，其中正常肾脏组织40个，ESRD组织75个，运用R语言软件对两组样本进行分析，共得到422个ESRD差异基因，其中包括98个上调基因，324个下调基因。差异基因热图见图1，火山图见图2。

图1 ESRD差异基因的热图

图2 ESRD差异基因的火山图

2.3 加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点 利用R语言软件取交集后共获得10个交集基因(即加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点)，分别为Fos原癌基因转录因子AP-1亚基(Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，FOS)、缺氧诱导因子1α亚基(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)、保守螺旋环螺旋结构域扩散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、RAS P21蛋白激活因子1(RAS P21 protein activator 1,RASA1)、晶状体蛋白ζ(crystallin zeta,CRYZ)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)、α-突触核蛋白(synuclein alpha,SNCA)、Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)、E1A结合蛋白P300(E1A binding protein P300,EP300)、中链酰基辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase medium chain,ACADM)。映射结果的韦恩图见图3。

图3 加味苏连温胆汤有效活性成分潜在作用靶点与ESRD差异基因的韦恩图

2.4 加味苏连温胆汤活性成分-疾病靶点的调控网络 将加味苏连温胆汤治疗ESRD的10个作用靶点导入CytoScape软件中，构建出活性成分-疾病靶点的调控网络(见图4)，10个作用靶点对应有效成分13个，包括乌索酸、1-柠檬烯、肉豆蔻酸、肉桂醛、黄芩苷元、芹黄素、孕酮、槲皮素、薯蓣皂甙元、蛇床子素、辛酸、乙酸葑酯、迷迭香酸，其中10个来自于苏叶，1个来自于萆薢，2个为多种药物共有，如图4所示。其中槲皮素(MOL000098)对应的靶点最多，可认为槲皮素是加味苏连温胆汤治疗ESRD的关键作用成分。

图4 加味苏连温胆汤活性成分-疾病靶点的调控网络

2.5 加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点的拓扑网络 将加味苏连温胆汤治疗ESRD的10个作用靶点导入到CytoScape 3.7.0软件中，使用Bisogenet和CytoNCA两个插件，构建交集基因的PPI网络，如图5(1)。将DC设置为>61，BC设置为>600，构建其拓扑网络，共得到7个候选基因，如图5(3)。其中EP300的度值最高，提示EP300是加味苏连温胆汤治疗ESRD的核心作用靶点。

图5 加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点的拓扑网络构建过程

2.6 GO功能富集分析结果 GO功能富集分析结果显示，加味苏连温胆汤治疗ESRD的10个作用靶点共涉及399种生物过程、10种分子功能、1种细胞组分。其中生物过程包括细胞对氧化应激的反应等，分子功能包括Tau蛋白连接等，细胞组分为转录因子复合物。见图6、图7、图8。

图6 GO功能富集分析-生物过程分析结果

图7 GO功能富集分析-分子功能分析结果

图8 GO功能富集分析-细胞组分分析结果

2.7 KEGG通路富集分析结果 KEGG富集分析结果显示，加味苏连温胆汤治疗ESRD的10个作用靶点主要涉及脂肪酸降解通路，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路，气泡图见图9。

图9 KEGG通路气泡图

3 讨 论

ESRD的主要病因是肾小球肾炎、慢性间质性肾炎、糖尿病肾病和高血压肾硬化等，涉及的病理变化包括肾小球间质纤维化、局灶性和节段性肾小球硬化、肾小管萎缩等[9]。晚期ESRD患者多会进入到尿毒症阶段，即慢性肾脏病肾功能衰竭的终末阶段。肾脏的滤过和代谢功能减退、毒素堆积及肾脏内分泌功能障碍均会引发电解质紊乱、酸碱代谢失衡和水钠潴留等现象，严重者可危及生命。目前，除肾移植和腹膜透析治疗外，维持性血液透析是延长大部分晚期ESRD患者生存期的主要方法[10]。虽然应用透析治疗有助于提高ESRD患者的生存率，但与普通人群相比，这些患者的生活质量明显降低[11]，且透析并不能解决全部问题，ESRD患者常伴有多种并发症，如肾性贫血、皮肤瘙痒、纳差、恶心呕吐、不宁腿综合征、高血压等，且至后期更为明显，严重影响患者的生活质量。然而，目前临床亦缺乏有效的针对性靶向治疗。

中药复方的组合形式往往多种多样，每一味药物含有的有效活性成分不同，在治疗疾病时具有多成分、多靶点、多通路的作用特点。中药复方往往是治疗ESRD这类受多种病理机制共同影响的疾病的重要方法，并且具有服用方便、副作用小的优势，能有效地缓解症状，从而提高患者的生活质量。但由于中药复方成分、治疗靶点、作用机制均复杂，传统药理学方法很难从整体的角度探讨加味苏连温胆汤的潜在生物学机制，尤其是相互关联的生物分子网络的调控。而生物信息学的方法可以很好地解决这一问题。因此本研究基于网络药理学和生物信息学的方法，寻找药物与疾病的共同基因，探讨中药复方多途径治疗ESRD的分子靶点及作用机制，以期进一步促进其在临床上的应用与相关机制的研究。

本研究共筛选出加味苏连温胆汤治疗ESRD的10个作用靶点，及其对应的13个活性成分，主要活性成分包括槲皮素、孕酮、黄芩苷元、芹黄素等，其中槲皮素对应多个作用靶点，如FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1α、EP300等，提示槲皮素很可能是加味苏连温胆汤治疗ESRD的关键多效活性化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎症、抗应激反应等作用，Yang等[12]发现，槲皮素除了可预防肾小管损伤和慢性间质炎症，还具有预防蛋白尿和改善肾功能的作用，其可剂量依赖性地抑制成纤维细胞生长因子23和甲状旁腺激素，这两种物质在调节肾脏的钙和磷含量中都起着至关重要的作用，而调节血液中的钙、磷含量对于治疗肾性骨病也有一定作用。研究显示，与其他性激素相比，内源性孕酮可增强女性对肾损害的抵抗，外源性孕酮也具有显著的抗氧化和肾保护作用，孕酮主要通过存在于肾单位中的膜孕酮受体α和γ发挥肾保护作用，参与调节肾功能，对缺血再灌注所致的大鼠急性肾损伤起着保护肾脏的作用[13]。而黄芩苷元也被证实可减少晚期氧化蛋白产物的积累，具有下调炎症细胞因子表达，以及保护肾小管上皮细胞免受氧化应激损伤的作用[14]。芹黄素则可在体内外发挥改善肾功能的作用，不仅可防止肾小管细胞凋亡，还能够减轻肾缺血再灌注损伤后肾小管细胞坏死、胞浆空泡化、肾小管上皮细胞空泡化等严重的肾损伤表现[15]。加味苏连温胆汤对ESRD的治疗作用可能与上述成分具有保护肾脏的作用有关。

本研究共获得10个加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用靶点，分别为FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1、CRYZ、CXCR4、SNCA、TLR4、EP300、ACADM；为了得到更精准的结果，在PPI网络构建中，通过设置DC与BC两个参数，最终确定了以EP300、BRCA1、TP53、ESR1、HSP90AA1、CUL3、NTRK1为主要基因的拓扑网络，其中EP300的度值最高，提示EP300是加味苏连温胆汤治疗ESRD的核心作用靶点。研究表明，EP300是人类纤维化的重要调节因子，调节肌成纤维细胞的多种生物过程，并在调节细胞外基质的产生与降解过程中发挥重要作用，可以导致肾脏纤维化[16-17]。在肾细胞癌的细胞中，EP300与稳定的低氧诱导因子1形成复合物，参与调控与肾透明细胞癌进展相关的基因编码因子的表达，如血管内皮生长因子、碳酸酐酶9和促红细胞生成素[18]。加味苏连温胆汤可能是通过调控EP300来发挥抗肾脏纤维化、抑制血管内皮生长因子表达、减少细胞外基质沉积的作用。

GO富集分析结果显示，加味苏连温胆汤治疗ESRD的作用与细胞对氧化应激的反应等生物过程，转录因子复合物等细胞组分，以及Tau蛋白连接等分子功能相关。氧化应激是指引起细胞损伤的高度反应性氧化分子的累积效应[19]，其参与了IgA肾病的发病机制[20]，也可作为炎症机制的重要组成部分对ESRD患者发生贫血有一定影响，是导致血液透析患者尿毒症发生率和病死率升高的主要因素[21]。复杂转录因子是能够以序列特异性方式结合DNA并且调节转录的一系列蛋白质。例如，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α是一种控制线粒体生物发生的转录因子，在一些肾脏疾病中具有保护肾脏的作用，可以减轻因线粒体变化而引起的急性肾损伤[22]。血管转录因子ETS原癌基因1转录因子(ETS proto-oncogene 1 transcription factor，ETS-1)是受血管紧张素Ⅱ调控的转录因子，研究表明血管紧张素Ⅱ对肾纤维化、炎症和氧化应激的诱导作用，有一部分是通过ETS-1介导的；ETS-1还参与了急性肾衰竭中肾小管再生的调控，而减少肾脏表达的ETS-1可以预防高血压相关的肾脏损伤[23]。Tau蛋白是一种多功能蛋白，属于与微管结合的原生未折叠微管相关蛋白家族，参与微管的组装并维持其稳定，广泛表达于中枢和外周神经系统，但也存在于肾脏、肺和睾丸[24]。既往有关Tau蛋白的研究多是针对阿尔茨海默病的，但本研究结果提示Tau蛋白可能也与慢性肾脏病的发生有关。

KEGG分析结果显示，加味苏连温胆汤主要是通过调节脂肪酸降解通路，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路来治疗ESRD。炎症和代谢失调是肾脏疾病最重要的特征。体外实验表明，脂肪酸氧化调节因子可以抑制肾小管上皮细胞腺嘌呤核苷三磷酸耗竭、细胞死亡、肾小管上皮细胞去分化和细胞内脂质沉积，而恢复脂肪酸代谢，可以保护小鼠免受肾小管间质纤维化的影响[25]。脂肪酸结合蛋白4在 IgA肾病患者肾小球组织中的表达水平显著高于无内皮增生性病变的患者[26]。此外，肾脏参与了氨基酸代谢的过程，其能够精细调控循环组织池中的氨基酸，对体内氨基酸的代谢平衡起到至关重要的作用；当肾脏功能受损时易发生氨基酸代谢紊乱，其中，肾实质发生病变时血浆中氨基酸谱亦会发生改变[27]。研究表明，2～3期慢性肾脏病患者体内瓜氨酸含量明显升高，而色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸等必需氨基酸，以及氨基丁酸、甘氨酸等非必需氨基酸含量均明显降低[28]。同时，纠正患者体内的氨基酸代谢平衡，也是维持肾脏功能的重要手段。

综上所述，加味苏连温胆汤中的多种活性成分可能通过与EP300、FOS、HIF-1α等10个交集基因相互作用，调控细胞对氧化应激的反应等生物过程，转录因子复合物等细胞组分，Tau蛋白连接等分子功能，进而单独或者共同调控脂肪酸降解通路及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路来发挥治疗ESRD的作用。但既往的研究极少涉及本研究获得的KEGG通路，今后可进一步研究这些通路在ESRD治疗中的作用。由于本研究为基于网络药理学和生物信息学的研究，加味苏连温胆汤的具体有效成分及其作用机制还有待更深入、更细化地挖掘，并需要进行相关实验佐证。