响应面法优化超声辅助提取荞麦中芦丁的工艺

黄菊+史小琴

摘要：为优化超声辅助乙醇浸提荞麦（Fagopyrum esculentum）中芦丁的工艺条件，利用响应面法优化荞麦芦丁提取工艺，以芦丁提取量为指标，通过单因素试验和响应面试验探讨超声时间、超声温度、液料比和乙醇体积分数对提取量的影响。结果表明，获得的最佳工艺为超声时间23 min、超声温度79 ℃、液料比30∶1（mL∶g）、乙醇体积分数90%。交互作用影响显著的因素为超声时间与乙醇体积分数、超声温度与乙醇体积分数。在此条件下进行验证，荞麦芦丁的提取量为0.416 1 mg/g，与模型预测值0.428 8 mg/g基本相符。模型可以较好地预测荞麦芦丁的提取量，响应面法对荞麦芦丁提取条件参数优化具有可行性。

关键词：荞麦（Fagopyrum esculentum）；超声波；芦丁；响应面法

中图分类号：S517；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5327-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.040

Abstract： In order to optimize the technological condition of ultrasonic-assisted ethanol extraction of rutin from Fagopyrum esculentum， taking the yield of rutin as the index， The effects of four main variables， i.e.， ultrasound time， ultrasound temperature， liquid-solid ratio and percentage of ethanol concentration on the extraction yeild of rutin were discussed by single-factor experiments， the optimal process of extracting rutin from Fagopyrum esculentum were obtained by response surface methodology. The results showed that， the optimum extraction conditions were as follows： extraction time of 23 mins， extraction temperature of 79 ℃， liquid-solid ratio of 30∶1 and ethanol concentration of 90%. The interactions were prominent between ultrasound time and ethanol concentration， also between extraction temperature and ethanol concentration. Under these conditions， a mean value of 0.416 1 mg/g（n=3） was observed， which was well matched with the predicted value of 0.428 8 mg/g. The proposed prediction model could accurately predict the extraction yield of rutin， which suggested it was feasible to optimize the extraction conditions of rutin from Fagopyrum esculentum using response surface methodology.

Key words： Fagopyrum esculentum； ultrasonic； rutin； response surface methodology

蕎麦（Fagopyrum esculentum）中含有大量的黄酮类化合物，其醇提物的主要成分为芦丁[1]。它具有显著的降糖功效，因而受到糖尿病患者的青睐，并被广泛用于降糖食品的研究开发[2]。从荞麦中提取芦丁的方法有索氏回流提取、热水浸提法和碱提酸沉等，贾冬英等[3]进行了系统的对比研究，认为乙醇浸提法操作简单，溶剂可回收、无毒害，是行之有效的提取方法。但在实际应用中因时间长、能耗大等因素限制了其工业化生产。而随着分离技术的进步，超声波、微波和超临界萃取等辅助提取天然植物中有效成分的新方法不断发展起来，在一定程度上缩短时间，节约了能耗，从而达到了提高生产效率的目的。超声波提取技术是利用超声波产生的机械骚动效应、热学效应和空化效应等物理化学过程来加速物质的扩散溶出而提高提取效率的一种较实用的提取方法[4，5]。将超声波用于荞麦黄酮的提取已有研究，文献[6-9]选择的原材料均为荞麦麸皮，优点是荞麦麸皮中黄酮类化合物含量较高，能够得到较高的提取率，但大量收集荞麦麸皮也存在一定困难。陈国安等[10]直接以荞麦为原料，采用响应面法确定了超声辅助提取荞麦黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数50%，超声温度35 ℃，超声时间30 min，液固比45∶1（mL∶g），此时，苦荞黄酮提取率为6.92%。

本研究拟在借鉴现有研究的基础上，利用超声波辅助乙醇浸提荞麦中的芦丁，通过响应面试验对提取工艺参数进行优化，对获得的荞麦芦丁提取工艺模型进行深入分析，并讨论双因素间的交互作用，以期为荞麦芦丁的开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦产地为山东枣庄；芦丁标准品：阿拉丁试剂（上海）有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ5200DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；722型可见分光光度计（配有1 cm比色皿）（上海悦丰仪器仪表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；DHG-9070A型鼓风干燥箱（苏州江东精密仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 荞麦中芦丁的提取 荞麦→干燥粉碎→过30目筛→乙醇预先浸泡→超声辅助提取→抽滤→滤液定容待测。

1.3.2 标准曲线的绘制 称取10 mg芦丁标准品溶于50 mL容量瓶中配制成0.2 mg/mL的标准储备液。然后分別移取0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL于25 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min， 10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液10 mL，用乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min。配制成0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的芦丁标准液，于510 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）对浓度（c）绘制标准曲线，经最小二乘法得到标准曲线方程：A=7.775c+0.017 6，R2=0.994 5。说明在 0～0.10 mg/mL吸光度和芦丁浓度呈良好的线性关系。

1.3.3 荞麦芦丁含量测定 从荞麦芦丁的提取液中移取2 mL于25 mL容量瓶中，滴加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min，然后滴加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液10 mL，定容至刻度，摇匀静置15 min后，于510 nm波长处测定吸光度。

式中，A为提取液吸光度；V0为荞麦芦丁提取液定容体积，mL；V1为荞麦芦丁提取液定容后吸取的体积，mL；V2为荞麦芦丁稀释液定容体积，mL；m为荞麦粉样品质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

1）超声时间。称取过30目筛的干燥荞麦粉0.5 g，在超声温度80 ℃、液料比30∶1（mL∶g，下同）和90%乙醇条件下，分别超声提取10、20、30、40、50 min。按照“1.3.3”的方法测定荞麦芦丁含量，考察超声时间对芦丁提取量的影响。

2）超声温度。称取过30目筛的干燥荞麦粉0.5 g，在超声时间20 min、液料比30∶1和90%乙醇条件下，按照超声温度40、50、60、70、80 ℃进行提取。按照“1.3.3”的方法测定荞麦芦丁含量，考察超声温度对芦丁提取量的影响。

3）液料比。称取过30目筛的干燥荞麦粉0.5 g，在超声时间20 min、超声温度80 ℃和90%乙醇条件下，按照液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1进行提取。按照“1.3.3”的方法测定荞麦芦丁含量，考察液料比对芦丁提取量的影响。

4）乙醇体积分数。称取过30目筛的干燥荞麦粉0.5 g，在超声时间20 min、超声温度80 ℃和液料比30∶1的条件下，分别按照乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%进行提取。按照“1.3.3”的方法测定荞麦芦丁含量，考察乙醇体积分数对芦丁提取量的影响。

1.3.5 Box-Behnken试验设计 根据单因素试验结果，以上述4个因素为考察变量，芦丁提取量为响应值，利用Box-Behnken设计方法进行响应面试验设计，试验设计采用Design-expert 8.0.6软件进行，试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间对提取量的影响 如图1所示，芦丁提取量随着超声时间的增加先增后减，在20 min左右形成拐点，分析可能是因为随着超声时间的延长，由于存在强烈的振动和热效应，使得芦丁结构部分被破坏，导致提取量减少。因此以超声时间20 min为宜。

2.1.2 超声温度对提取量的影响 由图2可知，40～70 ℃范围内随着超声温度的增加，芦丁提取量增加，超过70 ℃后，提取量下降。这主要是因为提高温度有利于黄酮类化合物的溶出，但温度过高，会使得提取液中的有效成分被破坏，且杂质的溶出量也增加，从而芦丁提取量减少，因此最佳的超声温度为70 ℃左右。

2.1.3 液料比对提取量的影响 由图3可知，随着液料比地增加，芦丁提取量先增后减，在30∶1时达到最大值，而后趋于平稳略有下降。考虑到节约溶剂量的因素，以液料比30∶1为宜。

2.1.4 乙醇体积分数对提取效果的影响 如图4所示，随着乙醇体积分数的增加，芦丁提取量也不断增加，达到80%～90%时，增加量逐渐平稳，因此以80%乙醇为宜。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理，对超声时间、超声温度、液料比和乙醇体积分数进行四因素三水平的响应面试验，结果见表2。

采用Design-expert 8.0.6进行多元回归拟合，得到响应值荞麦芦丁提取量（Y）对编码自变量超声时间（X1）、超声温度（X2）、液料比（X3）和乙醇体积分数（X4）的二次多项回归方程：

Y=0.37+0.038X1+0.022X2+0.023X3+0.034X4-0.014X1X2-5.05×10-3X1X3+0.067X1X4-9.4×10-3X2X3+0.073X2X4-4.3×10-3X3X4-0.027X12-0.040X22-0.059X32-0.11X42，对该模型进行回归方差分析和显著性检验，结果见表3。由表3可知，该模型的F=14.96，P<0.000 1，说明二次回归方程是极显著的，失拟项F=0.32，P=0.932 9，表明相对于纯误差，失拟现象不显著。模型的确定系数R2=0.937 3，反映了回归方程对响应值的解释能力为93.73%，而在多元回归拟合中，自变量个数对方程拟合的优度有影响，一般还需考虑调整确定系数R2Adj，本例中为0.874 7，它表明响应值的总变异中有87.47%可由所选的4个独立变量来解释。模型变异系数为10.46%，表明模型具有较高的可靠性和精确性。综上可知，该模型具有显著的统计学意义，可以用于荞麦芦丁提取工艺的优化。

从单因素的F值看出，各单因素对芦丁提取量的影响顺序为：超声时间>乙醇体积分数>液料比>超声温度。此外，P（X1X4）和P（X2X4）都小于0.005，表明两因素的相互作用中，超声时间和乙醇体积分数、超声温度和乙醇体积分数对荞麦芦丁提取量具有显著的交互作用，其余两因素间的交互作用不显著。

2.3 双因素间的交互影响作用分析

双因素间的交互影响因素可以从响应曲面图上直观的观察，曲面图坡度越陡峭，说明双因素交互作用显著，反之，坡度平缓则不显著。从图5可以看出，c和e的响应曲面比较陡峭，说明超声时间和乙醇体积分数、超声温度和乙醇体积分数对荞麦芦丁提取量具有顯著的交互作用，在此将交互作用显著的双因素影响的等高线图列出，如图6所示。从图6（左）可以看出，当超声时间较短时，芦丁提取量随着乙醇体积分数的增加先增后减，当超声时间较长时，提取量随着乙醇体积分数增加而增加；当乙醇体积分数较低时，提取量随着超声时间的增加略有下降；当乙醇体积分数较高时，提取量随着超声时间的增加而增加。并且乙醇体积分数地影响大于超声时间对提取量地影响。因此，适当地增加乙醇体积分数并选择合适的超声时间，可以有效提高芦丁提取量。

同理，图6（右）可以看出，当超声温度较低时，提取量随着乙醇体积分数的增加先增后减，当超声温度较高时，提取量随着乙醇体积分数的增加而增加；当乙醇体积分数较低时，提取量随着超声温度的增加变化不明显，当乙醇体积分数较高时，提取量随着超声温度地增加而增加，且乙醇体积分数对提取量的影响大于超声温度对提取量的影响。因此，选择适当增加乙醇体积分数，并选择合适的超声温度有利于提高荞麦芦丁的提取量。

根据响应面分析结果可得超声辅助乙醇提取荞麦中芦丁的最佳工艺参数为：超声时间23 min，超声温度78.66 ℃，液料比30.20∶1，乙醇体积分数89.67%，此时芦丁的理论提取量为0.428 8 mg/g。根据上述结果考虑实际情况，调整工艺参数为超声时间23 min，超声温度79 ℃，液料比30∶1，乙醇体积分数90%，进行3次验证试验，得到芦丁的平均提取量为0.416 1 mg/g（RSD=1.89），比理论提取量低2.96%，表明响应面法对荞麦芦丁提取工艺的优化具有可行性。

3 结论

研究选择超声时间、超声温度、液料比和乙醇体积分数4个对荞麦芦丁提取量影响较大的因素进行响应面试验，建立了相应的二次回归方程。方差分析和响应曲面分析表明，4个因素及其二次项对荞麦芦丁提取量具有显著影响，同时乙醇体积分数分别与超声时间和超声温度的交互影响显著。

荞麦芦丁最佳的超声提取工艺为：超声时间23 min，超声温度79 ℃，液料比30∶1，乙醇体积分数90%，验证试验得到的芦丁提取量为0.416 1 mg/g，低于理论预测值2.96%。表明该设计方法可用于荞麦芦丁超声提取工艺的分析和预测，具有较高的可靠性。

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