鼻咽癌组织中NOX4、miR-421的表达水平及其与患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性▲
2022-11-04陈梅林苏贞绍韦霞琳林栓全
陈梅林 苏贞绍 韦霞琳 梁 丹 林栓全
(钦州市第一人民医院1 肿瘤内科,2 呼吸内科,广西钦州市 535000)
鼻咽癌是鼻咽部常见的恶性肿瘤,发病率较高,常见症状有鼻涕带血、通气不畅等[1-3]。鼻咽癌的发病与遗传、环境、饮食等多种因素有关,其早期临床症状隐匿,大多数患者确诊时病情已发展至中晚期[4-5]。放疗是目前鼻咽癌的首选治疗手段,随着放疗技术的不断进步,鼻咽癌患者的局部控制率得到不断提高,其预后也在一定程度上得到改善,但患者体质各异,对放疗的敏感性参差不齐,因此疗效和预后也不尽相同[6-8]。因此,寻找评估鼻咽癌放疗效果的新型标志物成为研究的热点。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成员之一,在多种肿瘤中均有表达,与肿瘤的发生和发展密切相关[9]。miR-421是具有促癌效应的miRNA,在多种肿瘤组织中呈高表达水平,能够抑制癌细胞的凋亡、促进癌细胞的增殖[10]。本研究探讨鼻咽癌组织中NOX4表达情况、miR-421的表达水平及其与患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选取2019年1月至2021年1月在我院就诊的50例鼻咽癌患者作为病例组。纳入标准:(1)经病理活检确诊为低分化鳞状细胞癌;(2)均为初发鼻咽癌;(3)既往未接受过放化疗等抗肿瘤治疗。排除标准:(1)临床资料不齐全者;(2)精神异常或认知功能障碍者;(3)合并其他恶性肿瘤者;(4)合并严重感染性及心、肝、肾等脏器疾病者。另选取同期在我院治疗的30例慢性鼻咽炎患者作为对照组。纳入标准:患者鼻腔黏膜充血、肥厚,伴有肿物或糜烂,鼻腔内有脓痂充塞,经鼻内镜检查确诊为慢性鼻咽炎。排除标准:(1)近1个月内接受过地塞米松等药物治疗的患者;(2)对本次研究用药有禁忌证者;(3)合并代谢性疾病者;(4)合并心、肝、肾等脏器疾病者。两组患者的一般资料比较,差异无统计学意义(均P>0.05),具有可比性,见表1。本研究已获得我院医学伦理委员会批准,所有患者及家属均对本研究知情同意。
表1 两组患者一般资料的比较
1.2 治疗方法 鼻咽癌患者接受常规放疗:在CT模拟机下定位,在定位片上勾画靶区,靶区采用面颈联合野+下颈切线野。面颈联合野照射至36~40 Gy后,缩野为小面颈野,推量至60 Gy,如果患者存在颅内、颅底侵犯则进一步缩野推量至70 Gy;下颈切线野一般照射至50 Gy。放疗过程中应用挡铅减少放射线损害。每天治疗1次,每周治疗5次,共治疗35次。鼻咽炎患者给予经鼻雾化吸入治疗:经鼻吸入布地奈德混悬液(Astra Zeneca公司,批号:H20090903),每次1 mg(2 mL),2次/d,每侧鼻腔每次吸入时间约2.5 min(0.5 mg),共约5 min,疗程5 d。
1.3 免疫组化法检测NOX4的表达情况 两组患者经系统治疗前进行组织活检,将取得的病变组织置于4%多聚甲醛中固定,经石蜡包埋后制作成厚度为4 μm的切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法检测病变组织中NOX4的表达情况:将石蜡组织切片分别浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ内各10 min,再依次浸入不同浓度酒精中水化5 min,PBS冲洗3次,3 min/次;然后置入柠檬酸钠抗原修复缓冲液中进行抗原修复。在切片上滴加50 μL 3% H2O2,室温避光孵育10 min,PBS缓冲液洗涤3次,3 min/次;擦干组织周围的水分,滴加5%山羊血清,于室温下孵育10 min后甩干。NOX4一抗孵育过夜(稀释比例为1∶5 000,上海恒斐生物科技有限公司,批号:AR133303),TBST液洗膜3次,10 min/次,将PBS作为一抗的阴性对照,室温下辣根过氧化物酶标记山羊抗兔多克隆二抗(稀释比例为1∶8 000,武汉博士德生物工程有限公司,批号:A0208)孵育2 h,TBST液洗膜3次,10 min/次,二氨基联苯胺法显色,将组织切片用苏木素复染15 s后用流水冲洗3 min。在尼康SMZ745光学显微镜下(视野×200)随机选取5个视野(每个视野细胞数不少于200个)进行观察,细胞核呈棕黄色为阳性细胞,取5个视野细胞数平均值,计算阳性细胞百分比,阳性细胞百分比<5%定义为NOX4阴性表达,阳性细胞百分比≥5%定义为NOX4阳性表达。
1.4 实时荧光定量PCR检测miR-421的表达水平 两组患者经系统治疗前进行组织活检,取适量病变组织,采用miRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司,批号:20200513)提取组织总RNA,采用cDNA第一链合成试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司,批号:K1691)将RNA反转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号:SR1110)进行实时荧光定量PCR扩增。miR-421上游引物序列为5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′,下游引物序列为5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′;U6上游引物为5′-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3′,下游引物为5′-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3′。反应体系共20 μL,包括cDNA模板2.0 μL,上下游引物各0.4 μL,2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL,5×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL,Nuclease-free H2O 6.8 μL。反应程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性5 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。以U6为内参,采用2-ΔΔCt法计算miR-421的相对表达水平。
1.5 鼻咽癌临床分期和TNM分期的评价 治疗前按照中国鼻咽癌2008分期标准[11]对鼻咽癌患者进行临床分期,并采用美国癌症联合委员会2010年TNM分期标准[12]进行TNM分期。
1.6 鼻咽癌疗效评价 鼻咽癌患者于放疗结束后3个月复查鼻咽纤维镜、鼻咽部CT或MRI,根据实体瘤临床疗效评价标准[13]进行疗效评价,分为完全缓解、部分缓解、稳定、进展4个等级。疗效达到完全缓解和部分缓解定义为放疗敏感,稳定和进展定义为放疗不敏感。
1.7 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用独立样本t检验;计数资料以例数和百分比表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组患者病变组织NOX4表达情况和miR-421表达水平的比较 病例组患者病变组织的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均高于对照组(均P<0.05),见表2和图1。
表2 两组患者病变组织NOX4的表达情况和miR-421相对表达水平的比较
图1 两组患者病变组织中NOX4表达情况(免疫组化染色,×200)
2.2 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者临床病理特征的关系 T3~4期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于T1~2期患者(P<0.05);N2~3期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于N0~1期患者(P<0.05);M1期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均高于M0期患者(P<0.05);临床分期Ⅲ~Ⅳ期的鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。见表3。
表3 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者临床病理特征的关系
2.3 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者放疗敏感性的关系 根据实体瘤临床疗效评价标准将患者分为放疗敏感组22例与放疗不敏感组28例。放疗敏感组鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率、miR-421表达水平均低于放疗不敏感组鼻咽癌患者(均P<0.05)。见表4。
表4 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者放疗敏感性的关系
3 讨 论
放疗是鼻咽癌的主要治疗手段,但不同患者体质存在差异,放疗敏感性也参差不齐,放疗敏感性较好的患者在放疗后癌细胞增殖及转移得到有效控制,病情缓解,预后得以改善,而放疗敏感性较差的鼻咽癌患者在放疗后仍存在癌细胞残留、癌细胞转移、病情复发等情况。NOX4是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成员之一,在多种肿瘤如胶质母细胞瘤、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲状腺癌等中呈高表达水平[14]。研究表明,结肠癌病灶中NOX4的表达水平升高与患者临床特征和预后密切相关[15];NOX4过表达是口腔鳞状细胞癌患者手术切除病灶后预后较差的影响因素[16]。miR-421是与多种恶性肿瘤发生相关的miRNA,其在肺癌、乳腺癌、胃癌中均呈高表达水平[17-19]。目前,NOX4、miR-421在鼻咽癌中的作用机制尚不完全明确,故本研究探讨鼻咽癌组织中NOX4、miR-421的表达水平及其与鼻咽癌患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性。本研究对两组研究对象的病变组织进行免疫组化检测,发现NOX4主要定位于细胞核,并且病例组患者病变组织中的NOX4阳性表达率高于对照组,实时荧光定量PCR结果显示病例组病变组织中的miR-421表达水平高于对照组(P<0.05),这说明NOX4阳性表达及miR-421高表达水平与鼻咽癌的发生密切相关。本研究结果显示,T3~4期、N2~3期、M1期、Ⅲ~Ⅳ期鼻咽癌患者病变组织中的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均分别高于T1~2期、N0~1期、M0期、Ⅰ~Ⅱ期患者(均P<0.05),说明鼻咽癌患者病变组织中的NOX4阳性表达率及miR-421的表达水平与其临床病理特征密切相关,这提示NOX4、miR-421可能参与了鼻咽癌的进展,两者或许可作为评估鼻咽癌患者病情的标志物。
研究表明,鼻咽癌细胞对放疗的敏感性与患者的预后密切相关[20-21]。目前临床上尚缺乏可以反映鼻咽癌放疗敏感性的敏感指标[22]。病理特征可以在一定程度上判断鼻咽癌的恶性程度,但其对放疗敏感性的预测价值有限[23-24]。有学者发现,NOX4能够抑制肿瘤对放疗的敏感性[25]。有研究显示,NOX4的表达下调可以抑制胶质母细胞瘤的增殖、侵袭及肿瘤相关血管生成,提高其体外放射的敏感性[14],使用 NOX4 抑制剂处理人类肾癌细胞可增强癌细胞对放疗的敏感性[9]。本研究在放疗后对鼻咽癌患者放疗敏感性进行评价,并分析NOX4、miR-421与患者放疗敏感性的关系,结果显示,放疗敏感的鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率、miR-421表达水平均低于放疗不敏感的鼻咽癌患者(均P<0.05),表明鼻咽癌患者病变组织中的NOX4及miR-421的表达情况与鼻咽癌细胞的放疗敏感性具有相关性。
综上所述,鼻咽癌患者癌组织中NOX4、miR-421表达水平升高,NOX4、miR-421表达水平与鼻咽癌患者的临床病理特征、放疗敏感性密切相关。因此,靶向调控NOX4、miR-421表达水平或有可能改善鼻咽癌患者对放疗的敏感性,进而减少放疗后肿瘤的残留和复发,改善鼻咽癌患者的生存预后。