鼻咽癌组织中NOX4、miR-421的表达水平及其与患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性▲

陈梅林 苏贞绍 韦霞琳 梁 丹 林栓全

(钦州市第一人民医院1 肿瘤内科，2 呼吸内科，广西钦州市 535000)

鼻咽癌是鼻咽部常见的恶性肿瘤，发病率较高，常见症状有鼻涕带血、通气不畅等[1-3]。鼻咽癌的发病与遗传、环境、饮食等多种因素有关，其早期临床症状隐匿，大多数患者确诊时病情已发展至中晚期[4-5]。放疗是目前鼻咽癌的首选治疗手段，随着放疗技术的不断进步，鼻咽癌患者的局部控制率得到不断提高，其预后也在一定程度上得到改善，但患者体质各异，对放疗的敏感性参差不齐，因此疗效和预后也不尽相同[6-8]。因此，寻找评估鼻咽癌放疗效果的新型标志物成为研究的热点。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成员之一，在多种肿瘤中均有表达，与肿瘤的发生和发展密切相关[9]。miR-421是具有促癌效应的miRNA，在多种肿瘤组织中呈高表达水平，能够抑制癌细胞的凋亡、促进癌细胞的增殖[10]。本研究探讨鼻咽癌组织中NOX4表达情况、miR-421的表达水平及其与患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至2021年1月在我院就诊的50例鼻咽癌患者作为病例组。纳入标准：(1)经病理活检确诊为低分化鳞状细胞癌；(2)均为初发鼻咽癌；(3)既往未接受过放化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：(1)临床资料不齐全者；(2)精神异常或认知功能障碍者；(3)合并其他恶性肿瘤者；(4)合并严重感染性及心、肝、肾等脏器疾病者。另选取同期在我院治疗的30例慢性鼻咽炎患者作为对照组。纳入标准：患者鼻腔黏膜充血、肥厚，伴有肿物或糜烂，鼻腔内有脓痂充塞，经鼻内镜检查确诊为慢性鼻咽炎。排除标准：(1)近1个月内接受过地塞米松等药物治疗的患者；(2)对本次研究用药有禁忌证者；(3)合并代谢性疾病者；(4)合并心、肝、肾等脏器疾病者。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究已获得我院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均对本研究知情同意。

表1 两组患者一般资料的比较

1.2 治疗方法 鼻咽癌患者接受常规放疗：在CT模拟机下定位，在定位片上勾画靶区，靶区采用面颈联合野+下颈切线野。面颈联合野照射至36～40 Gy后，缩野为小面颈野，推量至60 Gy，如果患者存在颅内、颅底侵犯则进一步缩野推量至70 Gy；下颈切线野一般照射至50 Gy。放疗过程中应用挡铅减少放射线损害。每天治疗1次，每周治疗5次，共治疗35次。鼻咽炎患者给予经鼻雾化吸入治疗：经鼻吸入布地奈德混悬液(Astra Zeneca公司，批号：H20090903)，每次1 mg(2 mL)，2次/d，每侧鼻腔每次吸入时间约2.5 min(0.5 mg)，共约5 min，疗程5 d。

1.3 免疫组化法检测NOX4的表达情况 两组患者经系统治疗前进行组织活检，将取得的病变组织置于4%多聚甲醛中固定，经石蜡包埋后制作成厚度为4 μm的切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法检测病变组织中NOX4的表达情况：将石蜡组织切片分别浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ内各10 min，再依次浸入不同浓度酒精中水化5 min，PBS冲洗3次，3 min/次；然后置入柠檬酸钠抗原修复缓冲液中进行抗原修复。在切片上滴加50 μL 3% H2O2，室温避光孵育10 min，PBS缓冲液洗涤3次，3 min/次；擦干组织周围的水分，滴加5%山羊血清，于室温下孵育10 min后甩干。NOX4一抗孵育过夜(稀释比例为1∶5 000，上海恒斐生物科技有限公司，批号：AR133303)，TBST液洗膜3次，10 min/次，将PBS作为一抗的阴性对照，室温下辣根过氧化物酶标记山羊抗兔多克隆二抗(稀释比例为1∶8 000，武汉博士德生物工程有限公司，批号：A0208)孵育2 h，TBST液洗膜3次，10 min/次，二氨基联苯胺法显色，将组织切片用苏木素复染15 s后用流水冲洗3 min。在尼康SMZ745光学显微镜下(视野×200)随机选取5个视野(每个视野细胞数不少于200个)进行观察，细胞核呈棕黄色为阳性细胞，取5个视野细胞数平均值，计算阳性细胞百分比，阳性细胞百分比<5%定义为NOX4阴性表达，阳性细胞百分比≥5%定义为NOX4阳性表达。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-421的表达水平 两组患者经系统治疗前进行组织活检，取适量病变组织，采用miRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：20200513)提取组织总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司,批号：K1691)将RNA反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：SR1110)进行实时荧光定量PCR扩增。miR-421上游引物序列为5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，下游引物序列为5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物为5′-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3′，下游引物为5′-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3′。反应体系共20 μL，包括cDNA模板2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，5×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，Nuclease-free H2O 6.8 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-421的相对表达水平。

1.5 鼻咽癌临床分期和TNM分期的评价 治疗前按照中国鼻咽癌2008分期标准[11]对鼻咽癌患者进行临床分期，并采用美国癌症联合委员会2010年TNM分期标准[12]进行TNM分期。

1.6 鼻咽癌疗效评价 鼻咽癌患者于放疗结束后3个月复查鼻咽纤维镜、鼻咽部CT或MRI，根据实体瘤临床疗效评价标准[13]进行疗效评价，分为完全缓解、部分缓解、稳定、进展4个等级。疗效达到完全缓解和部分缓解定义为放疗敏感，稳定和进展定义为放疗不敏感。

1.7 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者病变组织NOX4表达情况和miR-421表达水平的比较 病例组患者病变组织的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均高于对照组(均P<0.05)，见表2和图1。

表2 两组患者病变组织NOX4的表达情况和miR-421相对表达水平的比较

图1 两组患者病变组织中NOX4表达情况(免疫组化染色，×200)

2.2 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者临床病理特征的关系 T3～4期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于T1～2期患者(P<0.05)；N2～3期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于N0～1期患者(P<0.05)；M1期鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均高于M0期患者(P<0.05)；临床分期Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率及miR-421表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。见表3。

表3 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者临床病理特征的关系

2.3 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者放疗敏感性的关系 根据实体瘤临床疗效评价标准将患者分为放疗敏感组22例与放疗不敏感组28例。放疗敏感组鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率、miR-421表达水平均低于放疗不敏感组鼻咽癌患者(均P<0.05)。见表4。

表4 NOX4、miR-421表达情况与鼻咽癌患者放疗敏感性的关系

3 讨 论

放疗是鼻咽癌的主要治疗手段，但不同患者体质存在差异，放疗敏感性也参差不齐，放疗敏感性较好的患者在放疗后癌细胞增殖及转移得到有效控制，病情缓解，预后得以改善，而放疗敏感性较差的鼻咽癌患者在放疗后仍存在癌细胞残留、癌细胞转移、病情复发等情况。NOX4是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成员之一，在多种肿瘤如胶质母细胞瘤、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲状腺癌等中呈高表达水平[14]。研究表明，结肠癌病灶中NOX4的表达水平升高与患者临床特征和预后密切相关[15]；NOX4过表达是口腔鳞状细胞癌患者手术切除病灶后预后较差的影响因素[16]。miR-421是与多种恶性肿瘤发生相关的miRNA，其在肺癌、乳腺癌、胃癌中均呈高表达水平[17-19]。目前，NOX4、miR-421在鼻咽癌中的作用机制尚不完全明确，故本研究探讨鼻咽癌组织中NOX4、miR-421的表达水平及其与鼻咽癌患者临床病理特征和放疗敏感性的相关性。本研究对两组研究对象的病变组织进行免疫组化检测，发现NOX4主要定位于细胞核，并且病例组患者病变组织中的NOX4阳性表达率高于对照组，实时荧光定量PCR结果显示病例组病变组织中的miR-421表达水平高于对照组(P<0.05)，这说明NOX4阳性表达及miR-421高表达水平与鼻咽癌的发生密切相关。本研究结果显示，T3～4期、N2～3期、M1期、Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者病变组织中的NOX4阳性表达率和miR-421表达水平均分别高于T1～2期、N0～1期、M0期、Ⅰ～Ⅱ期患者(均P<0.05)，说明鼻咽癌患者病变组织中的NOX4阳性表达率及miR-421的表达水平与其临床病理特征密切相关，这提示NOX4、miR-421可能参与了鼻咽癌的进展，两者或许可作为评估鼻咽癌患者病情的标志物。

研究表明，鼻咽癌细胞对放疗的敏感性与患者的预后密切相关[20-21]。目前临床上尚缺乏可以反映鼻咽癌放疗敏感性的敏感指标[22]。病理特征可以在一定程度上判断鼻咽癌的恶性程度，但其对放疗敏感性的预测价值有限[23-24]。有学者发现，NOX4能够抑制肿瘤对放疗的敏感性[25]。有研究显示，NOX4的表达下调可以抑制胶质母细胞瘤的增殖、侵袭及肿瘤相关血管生成，提高其体外放射的敏感性[14]，使用 NOX4 抑制剂处理人类肾癌细胞可增强癌细胞对放疗的敏感性[9]。本研究在放疗后对鼻咽癌患者放疗敏感性进行评价，并分析NOX4、miR-421与患者放疗敏感性的关系，结果显示，放疗敏感的鼻咽癌患者病变组织的NOX4阳性表达率、miR-421表达水平均低于放疗不敏感的鼻咽癌患者(均P<0.05)，表明鼻咽癌患者病变组织中的NOX4及miR-421的表达情况与鼻咽癌细胞的放疗敏感性具有相关性。

综上所述，鼻咽癌患者癌组织中NOX4、miR-421表达水平升高，NOX4、miR-421表达水平与鼻咽癌患者的临床病理特征、放疗敏感性密切相关。因此，靶向调控NOX4、miR-421表达水平或有可能改善鼻咽癌患者对放疗的敏感性，进而减少放疗后肿瘤的残留和复发，改善鼻咽癌患者的生存预后。