基于反向分子对接和网络药理学探讨姜黄素抗肿瘤作用机制

★ 李成 许静 孙晓旻 杨欢 姚景春 陈绪龙,2（.九江学院附属医院 江西 九江 332000；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

癌症是人类难以应对的顽症之一，GLOBOCAN 2018数据显示，中国癌症标化死亡率为130.1/10 万，位居全球第12位。由此可见，中国癌症的死亡率较高，已严重危害居民生命健康和社会发展［1］。在临床上，手术、放疗、化疗是国际公认的治疗手段，虽然它们对杀伤肿瘤细胞具有一定作用，但在另一方面，传统治疗方法会严重破坏人体免疫功能和生理功能。因此，医学上迫切需要寻找到新的治疗方案。近年来，越来越多的传统中药均被证实具有良好的抗肿瘤作用，尤其是随着生物信息学技术的不断进步，一些常用抗肿瘤中药作用机理的研究已取得了显著性进展。

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取出来的一种脂溶性多酚类化合物，在姜黄中含量最高，可达到3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮结构的色素［2］。大量体内外研究发现姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗增殖、诱导凋亡、抗肿瘤等作用［3-5］。体内外药效实验发现姜黄素类通过诱导恶性肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡及对肿瘤生长各期的抑制效应来发挥其抗癌作用，药理研究十分广泛。例如姜黄素可以通过促进细胞凋亡发挥抗膀胱癌作用［3］，还能够显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖和转移，具有治疗乳腺癌的潜在机制［6］，同时还能加强胃癌的治疗效果，在体外通过抑制胃癌细胞中PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活化，促进胃癌细胞凋亡性死亡［7］。虽已经有细胞实验研究结论的支撑，但姜黄素用于肿瘤治疗的作用靶点及其机制尚未明确。因此，本研究以人类常见疾病靶标为研究对象，基于反向分子对接术研究姜黄素抗癌的作用机理。

反向分子对接基于Fisher E 的“锁-钥匙模型学说”而提出。它以小分子化合物(天然产物、先导化合物及化学合成物) 为探针，在已知结构的靶点数据库内搜寻可能与之结合的生物大分子，通过空间和能量匹配相互识别形成分子复合物，进而预测药物潜在的作用靶点［8］。网络药理学是在系统生物学与计算机技术高速发展基础上发展起来的，运用各种组学、高通量筛选、网络可视化和网络分析等多种技术，通过“药物-通路-靶点-疾病”复杂的网络分析，系统综合地预测药物对疾病网络的干预及影响［9］。目前，反向分子对接术联合网络药理学探讨复方中药及单一组分药理作用机制的研究越来越多［10-12］，因此，为了更进一步研究姜黄素的抗肿瘤作用机制，以姜黄素为研究对象，采用Pharm Mapper 服务器以人类蛋白靶标为研究对象进行反向分子对接和网络药理学研究，以期探索姜黄素在人体抗肿瘤的作用靶点及其作用机制［10］。

1 材料和方法

1.1 靶点挖掘

采用Pharm Mapper（http://lilab-ecust.cn/ pharmmapper/,update:2019-04-10）预测姜黄素的潜在作用靶点，是一种基于配体结构特征的反向药效团匹配的靶点预测方法,通过反向药效团将查询化合物与内部药效团模型数据库匹配来识别潜在的药物靶点。该过程如下：Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, update:2020-02-25）是一种化学模组的数据库，在PubChem Compound输入关键词“Curcumin”获取姜黄素的3D化合物结构，保存为“sdf”文件格式。采用ChemBio3D 14.0（Copyright 1998-2021 PerkinElmer Inc）对3D化合物结构进行MM2能量优化并保存为mol2格式，将结果导入Pharm Mapper服务器，通过配体小分子和Targetbank，Drugbank，Binding DB和PDTD四大数据库中的药效团自动匹配进行潜在靶点的预测分析，根据文献进行参数设置，具体如下：Generate Conformers: yes; Maximum Generated Conformations:300; Select Target Set: Human Protein Target Only; Number of Reserved Matched Targets: 100［11］。选取 Z-score＞0.5 作为姜黄素的靶蛋白基因［13］。利用蛋白质数据库UniProt（https://www.uniprot.org/, update:2020-02-02）将采集到的靶点信息进行官方名称（official symbol）的校正，限定物种为“homo sapiens”，将靶点转换成对应的基因。

1.2 蛋白相互作用网络的构建及筛选核心靶标

STRING数据库(https://string-db.org/, update:2020-07-28)是一个在线搜索已知蛋白互作关系的平台，将姜黄素的靶蛋白基因导入STRING 数据库进行在线分析，限定研究物种为“Homo sapiens”，得到共表达网络图。利用 Cytoscape 3.8.2软件Tools模块中的“CytoHubba”进行网络分析，根据相关拓扑参数筛选核心靶点。

1.3 基因本体（Gene ontology，GO）富集分析

GO是一个功能系统，旨在阐明基因功能和基因产物的属性［14］。GO主要参与生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。

DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/, update:2020-10-28）是一个生物信息数据库，主要用于差异基因的功能和通路富集分析。将姜黄素抗癌靶基因导入 DAVID 数据库进行GO分析，设置P值＜0.05对GO富集有统计学意义。

1.4 KEGG通路富集

KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/,update:2020-12-20）是一种广泛使用的基因富集分析工具，将姜黄素所有抗癌靶标导入KOBAS数据库进行KEGG通路分析，限定研究物种为“Homo sapiens”，即可得到靶蛋白基因的KEGG 相关通路信息。借助KEGG 通路数据库（http://www.genome.jp/kegg/,update:2021-05-01）进行通路的可视化分析，通过图解来表示细胞内的生物学过程。

1.5 “化合物-靶点-通路”网络的构建

Cytoscape3.8.2（update:2020-10-24）是一个专注于开源网络可视化和分析的软件。它的核心是提供基础的功能布局和查询网络，并依据基本的数据的结合成可视化网络。因此，本研究利用该软件将“药物-靶点-通路”的相互关系进行可视化，在网络中，化合物、靶点和通路以节点（node）表示，化合物与靶点之间、通路与靶点之间的联系以边（edge）表示。节点的度数（degree）是与节点相连边的数量，degree越大就意味着这个节点的度中心性越高，该节点在网络中就越重要。根据化合物与靶点连接情况筛选出姜黄素的核心靶标。

1.6 “化合物-靶点”的分子对接

（1）配体处理从：Pubchem数据库下载姜黄素mol2格式3D结构，并使用AutodockTools1.5.6（update:2020-07-29）打开配体小分子，并加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。（2）受体处理：蛋白的三维结构从RCSB Protein Data Bank下载得到，作为本文对接所用的蛋白。在AutodockTools1.5.6中打开通过添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存成pdbqt 文件。（3）对接参数设置：确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，参数exhaustiveness 设置为20，其他参数均采用默认值。（4）运行及输出：采用Autodockvina1.1.2（update:2011-05-11）进行半柔性对接，选取affinity最佳的构象，作为最终的对接构象。

2 结果

2.1 姜黄素的靶标预测

本研究依托Pharm Mapper 服务器平台对姜黄素进行靶标预测，按照排名及打分，挑选出Z-score＞0.5的43 个人源蛋白靶标进行下一步的分析，见表1。

表1 姜黄素反向分子对接结果

2.2 PPI网络的构建与筛选

将“2.1”靶标基因导入STRING 数据库得到PPI 网络图，见图1。该网络包含42个节点，69条蛋白作关系。网络中各节点的平均局部聚类系数为0.614，平均中心接近度为0.377，平均介数为0.056。利用Cytoscape软件中“CytoHubba”插件分析其节点的网络拓扑学特征，筛选最重要的10个关键基因，见图2。这些关键基因包括：SRC（steroid receptor coactivator）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、肾素基因（REN）、细胞周期检测点激酶1（CHEK1）、醛酮还原酶1成员B1（AKR1B1）、细胞周期蛋白A2（CCNA2）、热休克蛋白A8（HSPA8）和超氧化物歧化酶2（SOD2）。其中SRC（degree=14）在网路图中具有较高的度，预测其可能是姜黄素抗肿瘤的核心靶点。

图1 靶点相互作用网络图（PPI）

图2 PPI网络的关键靶点

2.3 姜黄素抗肿瘤目标基因的GO分析

采用DAVID 6.8数据库进行姜黄素抗肿瘤靶基因的GO分析。结果显示在细胞组成（CC）方面，共富集了7条项目：细胞质、细胞外间隙、胞外外体、受体复合物、细胞周期蛋白A2-CDK2复合物、髓鞘及突触后密度，见图3A；10项条目富集在分子功能（MF），包括蛋白激酶活性、酶结合类固醇激素受体、3'，5'-环核苷酸磷酸二酯酶活性、相同蛋白质结合等，见图3B；本研究获得细胞分化和细胞反应、信号转导途径、代谢3个生物过程（BP）富集项，见图3C。

图3 姜黄素抗肿瘤靶点的GO分析

2.4 KEGG通路富集结果

由富集分析结果可知，总共得到了17 条与肿瘤相关的KEGG通路，见表2、图4。由图表可知，肿瘤通路富集的靶蛋白个数最多且富集因子最高；其次，前列腺癌通路和胃癌通路富集到了较多的靶基因且其富集因子较高。与姜黄素作用的靶蛋白基因在肿瘤通路、前列腺癌通路和胃癌通路富集结果见图5。

图4 姜黄素与肿瘤相关KEGG通路富集图

图5 KEGG 富集通路

表2 姜黄素与肿瘤相关KEGG 通路富集的基因

2.5 姜黄素的“化合物-靶点-通路”网络的构建

为了将化合物、靶点和通路的关系进行可视化，借助Cytoscape构建“化合物-靶点-通路”关系图，见图6，利用软件中的“networkAnalyzer”插件分析其节点的网络拓扑学特征，筛选网络中的核心靶标基因。从靶点角度分析，较为重要的蛋白靶点有CDK2、FGFR1、TGFBR1、RXRA、GSK3B、EGFR，其中EGFR、GSK3B、RXRA 在网络中占据较重，调控着多条癌症通路。

图6 姜黄素的化合物-靶点-通路相关网络

2.6 分子对接结果

根据“2.3”及“2.4”结果可知PPI网络中的核心靶基因为SRC，“化合物-靶点-通路”网络的核心靶标为EGFR、GSK3B、RXRA，故利用Autodockvina对姜黄素与以上4个靶基因进行分子对接。一般认为，vina评分值表明化合物与蛋白质之间具有一定的结合活性。vina评分越负，化合物与蛋白质的结合就越稳定［15］。对接结果显示，vina评分如下：姜黄素和SRC、EGFR、GSK3B和RXRA分别为-8.8、-8.6、-8.2和-9.0。姜黄素和抗肿瘤靶点的vina评分均为阴性且小于-6，表明姜黄素对SRC、EGFR、GSK3B和RXRA具有良好的结合活性，见图7。

图7 分子对接作用

3 讨论

3.1 姜黄素相关蛋白靶标的研究

本研究应用反向分子对接和网络药理学的方法，通过多个数据库和软件挖掘并获取姜黄素抗肿瘤作用的潜在靶基因和可能的信号通路。STRING软件可视化分析显示，SRC 靶点蛋白与大部分靶点发生直接或间接作用的关系，推测该靶点是姜黄素发挥作用机制的核心靶点。姜黄素对蛋白SRC的作用已有报道，Shakibaei M等［16］证实姜黄素可为耐药结肠癌细胞提供更有效的治疗策略，其机制是通过下调NF-FU B/PI-3K/Src 通路发挥抗肿瘤作用。另有研究发现姜黄素通过诱导miR-203 靶基因Akt2 和Src 下调，最终导致膀胱癌细胞增殖减少和凋亡增加［17］。

EGFR是“化合物-靶点-通路”关系网中最为核心的靶点，调控多条癌症通路。EGFR 是原癌基因c-erb-B1 的表达产物，在许多实体肿瘤中高度/异常表达，其与肿瘤细胞的生长、增殖、分化及凋亡有关［18-20］。查阅相关文献可知姜黄素能够下调EGFR和HER2/neu 蛋白激酶的活性，从而抑制癌细胞的生长［21］。此外，据相关研究显示姜黄素可通过降低EGFR 基因表达来抑制人结肠癌衍生的Moser 细胞的生长［22］。姜黄素还通过调节EGFR 蛋白水平来下调前列腺癌细胞中的EGFR 信号传导，抑制EGFR 酪氨酸激酶活性并阻断配体诱导的 EGFR 激活［23］。

除了基因EGFR，GSK3B 及RXRA 也具有较高的度，在癌症发生发展过程中起着十分重要的作用。GSK3B是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，具有多种生物学过程，与肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和转移过程密切相关［24］，而通过药物抑制GSK3B 可减弱肿瘤增殖并诱导凋亡［25］。因此，多数研究将GSK-3B作为潜在的治疗靶点，已有文献［26］报道姜黄素可以通过减少酪氨酸磷酸化和增加丝氨酸磷酸化的方式抑制细胞凋亡，这可能与GSK-3B受到抑制有关。RXRA是核受体超家族中重要的一类转录因子，它的生物学功能与许多疾病密切相关，如代谢性疾病和肿瘤等。Zhang R 等［27］的体外实验证实，RXRA 的激活可抑制癌细胞的增殖、迁移和血管生成，这些抑制作用是通过AKT 和FAK 磷酸化调节PI3K/AKT 信号通路来实现的。姜黄素对RXRA 的相互作用尚未见相关报道，有待我们后续进行进一步的验证。

3.2 姜黄素相关肿瘤通路的研究

KEGG 富集通路分析结果显示17 条通路与肿瘤显著相关。根据募集的基因数目及其富集P值进行排序，排名靠前的分别是肿瘤通路、前列腺癌通路、胃癌通路、非小细胞肺癌通路、大肠癌通路。

肿瘤通路：姜黄素在肿瘤通路上招募的基因数最多，P值也最为显著，提示该药物和抗肿瘤机制密切相关。KEGG 通路图中显示，主要通过细胞因子和细胞因子受体相互作用通道、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、Wnt 信号通路抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制细胞增殖。前期姜黄素和肿瘤相关研究发现姜黄素类通过诱导恶性肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡及对肿瘤生长各期的抑制效应来发挥其抗癌作用［3,6-7］，与本研究富集的通路相符。

前列腺癌通路：姜黄素在前列腺癌通路中富集因子较高，表明姜黄素抗前列腺癌的作用最强，相比较对其他肿瘤作用，具有一定的专一性。姜黄素抗前列腺癌的机理，已有学者的相关研究进行佐证［28-29］。Shilpa K 等［29］体外药效实验已证实姜黄素通过中断TGF-β信号传导来诱导PPAR-γ基因表达并抑制肝星状细胞活化，证明姜黄素可用作晚期前列腺癌的治疗策略。前列腺癌通路富集的姜黄素作用靶点基因有CDK2、EGFR、FGFR1、GSK3B、PDPK1，推断姜黄素在人体内通过PI3K/Akt/mTOR、MARK、细胞因子和细胞因子受体相互作用等通路，或者作用于CDK2、EGFR 等靶蛋白来发挥抗前列腺癌的作用。

胃癌通路：姜黄素作用的靶蛋白基因在胃癌通路中的富集，推测姜黄素对胃癌具有一定的治疗作用。从通路富集图中可知，主要通过PI3K/Akt 信号通路、MARK 信号通路和Wnt 信号通路抑制癌细胞存活、增殖及分化；通过抑制RXR 的表达来阻止癌细胞DNA 的合成；通过阻断CDK2 的表达来调控肿瘤细胞周期。相关文献表明姜黄素确实有胃癌的治疗作用［7,30］，与化疗药物的联用，在降低化疗药严重不良反应的同时，还能通过相应的分子机制增强抗癌作用［31］。

非小细胞肺癌通路：姜黄素在非小细胞肺癌通路KEGG富集中P值排名相对较前，推测姜黄素具有抗非小细胞肺癌的作用。通路富集图中显示PI3K/Akt信号通路和ErbB信号通路与肿瘤细胞的凋亡相关，与文献报道的姜黄素能够显著上调miR-192-5p和抑制PI3K/Akt信号通路来抑制人非小细胞肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡，具有治疗非小细胞肺癌的潜在作用一致［32］。

大肠癌通路：通过姜黄素作用于靶蛋白基因在大肠癌通路中的富集，说明姜黄素具有抗大肠癌的作用。KEGG 通路图中显示ErbB 信号通路、Wnt信号通路及PI3K/Akt信号通路参与癌细胞的增殖和凋亡。Marjaneh R M等［33］通过构建结肠癌大鼠模型发现姜黄素通过调节Wnt 途径抑制了大肠癌细胞的生长和侵袭行为。体外细胞实验证实姜黄素可能通过抑制PI3-K/Akt 信号通路的活化，从而抑制结肠癌细胞增殖和诱导细胞凋亡［34］。以上研究结果与通路富集结果一致。

综上所述，本文基于反向分子对接和网络药理学方法，以姜黄素为研究对象，对该化合物抗肿瘤的潜在人源靶蛋白进行了反向虚拟筛选，并对潜在靶点进行了蛋白相互作用研究，以及KEGG 富集分析。结果表明姜黄素在肿瘤治疗领域具有较好的研究前景，可作为治疗多种肿瘤的一个新的潜在药物，其功能分析显著富集于前列腺癌和胃癌通路。但反向分子对接也有一定的局限性：计算机模拟对接数据不能完全代替体内实验数据；对接分数高、亲和力高的不一定就说明配体作用较好［35］。因此，还需要利用开展相应的体内外生物学实验进行验证，以便更科学有效地助力中药现代化研究。