基于网络药理学及分子对接技术分析清眩降压汤治疗高血压的作用机制

张媛洁，许 文，吴水生，3*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122；3.福建省中药产业技术开发基地，福建 福州 350122）

高血压（hypertension，HTN）在中医学上归属于“眩晕”“头痛”范畴，其中医病名为“风眩”，病位在心、肝、脾、肾，病性有实有虚，也有虚实夹杂。风眩分为肝火上炎、痰湿内阻、瘀血内阻、阴虚阳亢、肾精不足、气血两虚、阴阳两虚等证型［1］。清眩降压汤（Qingxuan Jiangya Decoction，QXJYD）是国医大师陈可冀院士治疗HTN 肝肾阴虚、肝阳上亢证的经验方，由苦丁茶、天麻、黄芩、牛膝、生杜仲、夜交藤、鲜生地黄、桑叶、菊花和钩藤组成，具有补益肝肾、清泄肝热、平抑肝阳的功效，主治肝阳上亢型HTN 引发的眩晕、头痛、睡眠障碍等症，疗效确切［2-3］。此外，该方也可控制SHR 大鼠血压的升高，减轻由HTN 引发的心肌肥厚。前期研究表明：QXJYD 抑制SHR 大鼠血压升高以及主动脉血管重构的主要机制与其活性成分能够降低血清中AngⅡ、ET-1 含量和RPA 活性水平以及抑制血管平滑肌细胞中PCNA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的蛋白表达有关［4］。然而，QXJYD 治疗HTN 的作用机制尚未明晰，仍有待进一步阐明，因此，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术系统地探讨QXJYD 治疗HTN 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 QXJYD活性成分及作用靶标的获取 采用TCMSP 数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 作为阈值，对QXJYD 活性成分进行筛选，并检索数据库

TCMID（http：//negabionet.org/tcmid/）、ETCM（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb）对QXJYD 的活性成分进行补充。通过DrugBank（https：//www.drugbank.com）和BATMAN-TCM 数据库识别与QXJYD 活性成分相关的作用靶标，合并两数据库所获的作用靶标，剔除重复项，借助UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org）校正靶标基因名，设置基因来源为“Human”，获取QXJYD 活性成分作用靶标。

1.2 HTN 作用靶标的获取 在GeneCards（http：//www.genecards.org）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）和TTD 数据库（https：//www.disgenet.org）中，以“hypertension”作为关键词检索HTN 的作用靶标。为提高准确性，GeneCards 中靶标按相关分值由高到低排序，并以分值大于中位数作为筛选条件，筛选2 次，仅保留排序靠前的作用靶标，最后以三者并集非重复靶标作为HTN 作用靶标。

1.3 QXJYD-HTN 交集靶标韦恩图的构建 利用Venny 2.1.0 在线绘图工具绘制韦恩图，对QXJYD活性成分作用靶标与HTN 作用靶标相映射，获得QXJYD 治疗HTN 的交集靶标。

1.4 活性成分-交集靶标网络的构建与分析 利用Cytoscape 3.7.1 软件对所获活性成分与交集靶标进行活性成分-交集靶标网络的构建，筛选度值（DC）从大到小排序的前20 的活性成分作为主要活性成分。

1.5 交集靶标蛋白互作（PPI）网络的构建与分析将交集靶标导入STRING 数据库（https：//stringdb.org），将物种设为“Homo Sapiens”，最低阈值设为≥0.900，舍弃与其他靶标无相互作用的孤立靶标，进行PPI 分析；将分析所得数据导入Cytoscape 3.7.1软件构建交集靶标PPI 网络，并通过MCODE 算法，默认参数设置，对整个PPI 网络进行聚类，识别得到交集靶标PPI 网络中潜在的各个子网络；最后将交集靶标的接近中心性（CC）、中介中心性（BC）和DC 分别从大到小排序，以三者大于各自中位数作为筛选条件，筛选2 次［5-6］，保留符合条件的交集靶标作为关键靶标。

1.6 GO 生物功能分析与KEGG 通路富集分析 将交集靶标导入基因富集分析工具（Metascape，http：//metascape.org/），物种设置为“H.sapiens”，其他参数为默认设置，对交集靶标分别进行GO 的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）与分子功能（MF）分析以及KEGG 通路富集分析。

1.7 分子对接 为进一步探究QXJYD 对HTN 的调控作用，选取主要活性成分与关键靶标进行分子对接验证。借助PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取主要活性成分的小分子配体，用Chem3D 软件对其优化力学结构，并在AutoDock-Tools 软件中检测配体root、选择配体可旋转键；随后，利用RCSB-PDB 数据库（http：//www.RCSB.org/）获取关键靶标的蛋白受体，使用PyMoL 软件移除关键靶标蛋白受体结构中的水分子以及小分子配体，并导入AutoDockTools 软件中进行加氢、计算电荷、添加原子类型的处理，根据二者作用位点，确定对接区域；最后，使用AutoDock Vina 软件进行分子对接来获取二者的最低结合能，并利用PyMoL 软件对分子对接结果进行可视化展示。

2 结 果

2.1 QXJYD 活性成分与作用靶标信息 借助中药数据库，获取活性成分142 个，见表1。通过化合物信息数据库获取作用靶标，经UniProt 数据库标准化后，最终得到364 个活性成分作用靶标。

表1 QXJYD“中药-活性成分-作用靶标”基本信息

2.2 HTN 作用靶标信息 通过疾病数据库，获取HTN 作用靶标2 313 个。

2.3 QXJYD-HTN 交集靶标韦恩图 通过Venny 2.1.0 在线绘图工具，确定231 个交集靶标，见图1。

图1 QXJYD-HTN 交集靶标维恩图

2.4 活性成分-交集靶标网络的分析结果 利用Cytoscape 3.7.1 软件构建活性成分-交集靶标网络，见图2。该图包含373 个节点（142 个活性成分和231 个交集靶标节点），2 445 条边。由图2 可知：QXJYD 每个活性成分均能与一个或多个靶标相互作用，体现了其多成分、多靶标间协同作用的机制。表2 展示了按照药物归属以及根据DC 从大到小排序的前20 的主要活性成分，如槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，这些主要活性成分可能在治疗HTN 中发挥一定的功效。

表2 QXJYD 主要活性成分相关信息

图2 活性成分-交集靶标网络图

2.5 交集靶标PPI 网络的分析结果 通过Cytoscape 3.7.1 软件，构建交集靶标的PPI 网络，见图3，该图具有201 个节点，986 条边。运用MCODE 算法获取3 个分别以CXCL8、SRC、EGFR 为核心的紧密联系的子网络，见图4～图6，推测QXJYD 可能通过上述子网络之间的联合作用治疗HTN。最后，以CC、BC 和DC 三者排序大于中位数作为筛选条件，对含201 个节点，986 条边的交集靶标的PPI 网络进行一次筛选，构建一个具有66 个节点和458 条边的PPI 网络图，同法进行二次筛选，构建一个具有21个节点和109 条边的关键靶标PPI 网络图，筛选过程见图7，获得关键靶标相关信息见表3。

图3 交集靶标的PPI 网络图

图4 以CXCL8 为核心的子网络

图6 以EGFR 为核心的子网络

图7 关键靶标筛选流程图

由表3 可知：QXJYD 活性成分可能通过作用于靶标磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、SRC 激酶（SRC）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、激活子蛋白-1（JUN）、肿瘤抑制蛋白p53（TP53）、肿瘤坏死因子（TNF）、磷酸化细胞核因子（RELA）、表皮生长因子受体（EGFR）、白介素6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、钙黏着蛋白关联蛋白（CTNNB1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受体α（ESR1）、CXC 主题趋化因子配体8（CXCL8）、表皮细胞生长因子（EGF）、F2、糖皮质激素受体基因（NR3C1）、白介素4（IL-4）治疗HTN。

表3 QXJYD 治疗HTN 的关键靶标相关信息

图5 以SRC 为核心的子网络

2.6 GO 生物功能分析及KEGG 通路富集分析 GO生物功能分析涉及BP、CC 和MF 分析，将各自基因数排名前10 位的GO 条目绘制成柱状图，见图8。由图8 可知：GO 生物功能分析主要涉及细胞对氮化物的反应、对细胞外刺激的反应、血液循环、细胞组分、细胞质膜、氧化还原酶活性、蛋白质同二聚化活性、蛋白域特异性结合等方面。KEGG 通路富集分析主要涉及MAPK 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1信号通路等220条HTN相关信号通路。KEGG通路富集分析信号通路见表4（相关靶标仅展示关键靶标）。

表4 QXJYD 治疗HTN 的KEGG 通路富集分析

图8 交集靶标的GO 生物功能分析图

2.7 分子对接验证 本研究使用分子对接软件Autodock vina 对DC 排名靠前的10 个主要活性成分槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、天麻素和异钩藤碱等与5 个关键靶标AKT1、IL-6、SRC、TNF、VEGFA 进行分子对接验证，最低结合能计算结果见表5。选用结合能较低的黄芩素与SRC、天麻素与VEGFA进行分子对接可视化展示，见图9。一般认为结合能＜0 kcal/mol 的配体与受体可自发结合［7］，结合能≤-5.0 kcal/mol 说明活性成分与作用靶标之间有较好的结合活性。而结合能越小，则说明小分子配体与靶标蛋白受体的构象形状匹配越接近，结合能力越强，能量也越低［8］。表5 显示：所有主要活性成分与关键靶标的最低结合能均≤-5.0 kcal/mol，提示筛选出的关键靶标与对应的主要活性成分之间对接构象稳定，具有较好的结合活性。其中，齐墩果酸与AKT1、IL-6、VEGFA，大黄素与SRC，黄芩素与TNF 结合能最小，对接构象最稳定，结合能力最强。结合图9 的分子对接可视化结果可知：关键靶标能够与主要活性成分自发结合并借助氢键等分子间作用力形成较稳定的对接构象。

表5 主要活性成分和关键靶标的分子对接结果

图9 QXJYD 主要活性成分-关键靶标对接的可视化展示

3 讨 论

通过活性成分-交集靶标网络分析得到20 个主要活性成分，包含β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、黄芩素和天麻素等。实验表明：β-谷甾醇具有抗炎作用，其作用机制可能与减少NO 的合成，减少炎性因子IL-1、IL-6、TNF 等的分泌，抑制游离细胞迁移等有关［9］；山柰酚和槲皮素同属于黄酮类化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化的作用［10-11］；黄芩素通过促进内皮细胞eNOS 蛋白表达与NO 释放增强乙酰胆碱对血管的舒张作用，从而有效地扩张血压，达到降压的目的［12］；天麻素能降低循环中的AngⅡ，增加NO 含量，具有舒张血管，增强主动脉和大动脉等血管的弹性，以及改善血管内皮功能的作用，从而达到降压的目的［13］。由此可见，QXJYD主要活性成分是通过抗炎、抗氧化和舒张血管等功能来实现治疗HTN 的作用。

通过PPI 网络分析得到21 个关键靶标，包含MAPK1、SRC、AKT1、VEGFA 和JUN 等。MAPK1 与AKT1 为血管内皮障碍相关靶标，能够促进血管内皮细胞的增殖与血管生成，与HTN 的发生密切相关［14］；SRC 参与VEGF 诱导的NO 和PGI-2 生成，可认为SRC 参与了VEGF 调节血管张力、舒张血管以及降压的过程［15］；VEGFA 与血压升高呈正相关，其与血管损伤、动脉粥样硬化密切相关，是预测和治疗HTN 的重要指标［16］；JUN 是激活子蛋白-1（AP-1）的组成之一，活化的AP-1 可以调控炎症因子，如IL-6、TNF 等的表达，引起血管内皮细胞及炎症细胞的增殖，血管阻力增加从而导致血压升高，故认为JUN 在治疗HTN，特别是在免疫抗炎方面发挥着重要的作用［17］。

通过KEGG 通路富集分析可知：关键靶标主要富集在MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 等信号通路上，这些通路与细胞凋亡、炎症反应、氧化应激密切相关。研究表明MAPK 活性的增加与HTN 表型密切相关，内皮细胞的完整性及局部AngⅡ、ET-1 和NO 的交互作用在维持血管结构方面具有重要作用，它们产生的分子机制与MAPK 信号通路密切相关［18］；TNF 信号通路与炎症反应有关，TNF 信号通路异常调节会导致血管内皮细胞受损，平滑肌细胞增生，血管外周阻力增加而引起HTN［19］；PI3K-Akt信号通路可通过下调NF-κB、HIF-1、CasP9 等蛋白因子的表达，通过发挥降低炎症反应，减少细胞凋亡等功能，达到治疗HTN 的目的［20］。以上内容提示，MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 信号通路在研究HTN 的发生发展中均占有重要位置。

本研究采用分子对接技术对QXJYD 主要活性成分与关键靶标进行分子对接验证。结果显示：主要活性成分均能与关键靶标具有较好的结合活性。该结果说明QXJYD 可能通过槲皮素、黄芩素和天麻素等主要活性成分作用于AKT1、SRC 和VEGFA等关键靶标，从而达到治疗HTN 的效果。

本研究利用网络药理学方法和分子对接技术系统地揭示了QXJYD 治疗HTN 的作用机制，反映了QXJYD 对HTN 多成分、多靶标、多途径的调控理念。但本研究是基于现有数据的挖掘，许多活性成分、疾病靶标以及生物学过程仍有待开发，为进一步研究其发挥作用的药效物质基础和作用机制，将基于网络药理学的初步探讨与体内外实验验证相结合，才能真正说明网络药理学研究结果的准确性和可靠性。