真菌Neoascochyta argentina NBERC-H82的次级代谢产物研究

王月莹 杨素梅 刘芳 刘曼莉 张志刚 杨曦亮 方伟,*

(1 湖北省农业科学研究院 湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064；2 武汉科技大学医学院药学系，武汉 430081)

真菌是植物病害的主要病原微生物，占比达到70%～80%[1]。植物真菌病害侵染能力强，发病迅速，往往导致植物减产甚至绝收。据统计，单对主要粮食如水稻、小麦和玉米，真菌病害就给全球农业带来每年600亿美元的经济损失，如果能完全控制植物真菌病害，全球每年可多养活6亿人[2]。随着真菌自我进化以及环境因素等，仍需要不断研发新的抗菌药物来保证全球粮食安全。在现代农药的研发过程中，活性天然产物发挥着不可替代的重要作用，至今超过60%的市场销售农业抗真菌药物来源于天然产物或者天然产物母核结构[3-4]。

随着活性新颖、结构独特化合物发现越来越困难，特殊生境微生物如极端环境，海洋微生物和致病微生物等受到越来越多关注[5-7]。致病微生物特别是植物病原菌，在与宿主的长期相互作用，相互进化的和影响下，可以代谢产生大量的活性化合物，具有极大的挖掘潜力[8]。在筛选农业抗菌活性化合物研究中，从稗草病斑中分离得到一株真菌Neoascochyta argentinaHBERC H-82，摇瓶发酵后采用乙酸乙酯提取，抗菌活性测试表明乙酸乙酯提取物具有显著的抗真菌活性，对乙酸乙酯提取物进行分离，共鉴定出6个化合物。对分离化合物进行抗菌活性评价，部分化合物对于灰葡萄孢菌显示抑菌活性，这为开发利用该菌株成为活菌制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCE(500 MHz)核磁共振仪(TMS为内标，δ为ppm，J为Hz)(德国Bruker BioSpin公司)；Waters 2695液质联用仪(美国Waters公司)；Waters 2767高效液相制备仪(Waters 2525泵，2767自动收集系统，2996二极管阵列检测器，色谱工作站Masslynx V4.0)；色谱柱：Sunfire C18OBD制备柱(5 μm,19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，爱尔兰)；柱色谱Sephadex LH-20凝胶(GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)。提取分离用试剂石油醚，乙酸乙酯和乙腈均为国药集团生产。青霉素(ampicillin，T0814L，99.27%)和链霉素(streptomycin sulfate，0060，720IU)购自上海陶素生化科技有限公司。放线菌酮(actidione)购自于Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司。

1.2 实验材料

发酵菌种分离于稗草[Echinochloa crusgalli(L.)Beauv]病斑(2020年5月采集于湖北省鄂州市郊外)，通过形态鉴定和18S rRNA编码基因序列比对分析鉴定为Neoascochyta argentina(相似度为99.6%)，现菌种保存于湖北省生物农药工程研究中心(编号为NBERC-H82)。

大肠埃希菌(Escherichia coli，ATCC25922)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)购买于中国典型培养物保藏中心，猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiaeWH13013)、猪链球菌(Streptococcus suis,SC19)由华中农业大学谭臣教授课题组提供，病原菌分离于湖北省农场病猪体内。禾谷镰孢菌(Fusarium graminearumSchw.)，番茄尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersiciSnyder et Hansen)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分离于染病植物叶片或果实。

1.3 发酵与提取

从保藏斜面管中挑取菌株H-82，接于PDA培养皿(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L)中，放置培养架上28℃恒温培养6 d，将菌块转接于500 mL锥形瓶(含175 mL发酵液，麦芽糖6.25 g/L，麦芽提取物 6.25 g/L，酵母提取物1 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，硫酸镁0.625 g/L)，28℃摇床振荡培养7 d，最终获得15 L发酵液。向每瓶发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯提取液，40℃减压浓缩得到乙酸乙酯提取物。

1.4 分离

乙酸乙酯提取物经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:1，每个梯度洗脱200 mL)，合并相同部分得到6个组分(Fr.A～F)。Fr.B经葡聚糖凝胶LH-20柱层析，用甲醇洗脱分离得到4个部分(Fr.B1～B4)。Fr.B2通过制备型高效液相色谱(Pre-HPLC)以乙腈-0.2%乙酸水(0～25 min，60%～100%乙腈，24 mL/min)洗脱得到化合物2(1.4 mg，Rt 11.64 min)；Fr.B3通过Pre-HPLC经乙腈-0.2%乙酸水(0～28 min，25%～100%乙腈，24 mL/min)梯度洗脱，分别得到化合物3(25.1 mg，Rt 19.60 min)和化合物4(1.4 mg，Rt 23.69 min)；Fr.B4通过Pre-HPLC以乙腈-0.2%水(0～30 min，30%～100%乙腈，24 mL/min)溶剂梯度洗脱化合物1(2.9 mg，Rt 8.33 min)。将Fr.C溶于甲醇后，用制备型高效液相色谱以乙腈-0.2%乙酸水(0～35 min，5%～100%乙腈，20 mL/min)梯度洗脱得到化合物5(3.7 mg，Rt 14.45 min)；Fr.F溶于甲醇后，用Pre-HPLC，以乙腈-水(0～25 min，20%～90%乙腈，24 mL/min)梯度洗脱，在13.62 min时得到化合物6(12.0 mg)。

1.5 化合物抗菌活性测定

将测试样品用DMSO配置成10 mg/mL浓度的母液，用菌种培养基稀释，使加入到96孔培养板最终浓度依次为100，50，25，12.5，6.25和3.12 mg/mL。将病原菌制成菌悬液浓度约为1×108CFU/mL，再将菌悬液稀释后加入96孔培养板中(浓度约为1×106CFU/mL)，然后加入药物浓液，每种药物每株菌做3个重复，同时设阴性对照和阳性对照。抗细菌对照药物选择青霉素、链霉素，抗真菌对照药物为放线菌酮。恒温箱中放置培养一定时间后(细菌为37℃培养24 h，真菌为28℃培养72 h)，读取结果。肉眼观察微量稀释孔中以无细菌生长现象的最高药物稀释浓度为该药物对该种细菌的药物最小抑菌浓度(MIC)。平行操作3次，以3次结果的平均值为此药对该细菌的MIC。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定(图1)

图1 化合物1～6结构式Fig.1 The chemical structures of compounds 1～6

化合物1，白色粉末，ESI-MS:m/z287.1 [M-H]-。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.71(1H，s，H-1)，5.31(1H，dd，J=12.0，3.0 Hz，H-3)，4.99(1H，d，J=12.0 Hz，H-3)，6.32(1H，d，J=1.5 Hz，H-4)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.15(2H，s，H-10，12)，2.15(3H，s，H-14)，3.72(3H，s，H-15)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 79.5(C-1)，74.4(C-3)，143.1(C-3a)，98.1(C-4)，162.8(C-5)，101.7(C-6)，153.5(C-7)，120.3(C-7a)，111.5(C-8)，157.2(C-9，13)，109.3(C-10，12)，140.3(C-11)，21.4(C-14)，55.9(C-15)。上述波谱数据与文献报道[9]一致，故化合物被鉴定为ascomfuran A。

化合物2，白色粉末，ESI-MS:m/z509.4 [M+H]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ 2.00(1H，m，H-1a)，1.13(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.84(1H，m，H-2b)，4.79(1H，m，H-3)，1.54(1H，m，H-5)，1.72(2H，m，H-6)，2.19(1H，t，J=5.5 Hz，H-7a)，1.72(1H，m，H-7b)，1.65(1H，dd，J=9.0，3.0 Hz，H-9)，2.49(1H，m，H-11a)，2.26(1H，m，H-11b)，6.56(1H，s，H-14)，1.05(3H，s，H-17)，1.30(3H，s，H-18)，0.91(3H，s，H-19)，3.87(1H，d，J=8.5 Hz，H-20a)，3.84(1H，d，J=8.5 Hz，H-20b)，2.02(3H，s，3-OAc)，2.04(3H，s，20-OAc)，7.84(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.9(C-1)，23.8(C-2)，75.3(C-3)，41.9(C-4)，48.2(C-5)，20.0(C-6)，41.1(C-7)，82.1(C-8)，52.7(C-9)，36.5(C-10)，18.1(C-11)，100.3(C-12)，165.5(C-13)，99.8(C-14)，159.8(C-15)，166.6(C-16)，16.9(C-17)，20.7(C-18)，13.3(C-19)，66.0(C-20)，172.4(3-O-CO-CH3)，21.0(3-O-COCH3)，172.6(20-O-CO-CH3)，20.9(20-O-CO-CH3)，132.6(C-1′)，126.4(C-2′，6′)，130.1(C-3′，5′)，131.8(C-4′)。上述数据与文献报道化合物[10]核磁数据一致，故化合物被鉴定为phenylpyropene B。

化合物3，白色粉末，ESI-MS:m/z451.4[M+H]+。1H NMR(500 MHz，CD3Cl)δ 1.81(1H，m，H-1a)，1.18(1H，td，J=13，3.5 Hz，H-1b)，1.73(1H，m，H-2a)，1.69(1H，m，H-2b)，4.50(1H，dd，J=12.0，5.0 Hz，H-3)，1.09(1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-5)，1.81(2H，m，H-6)，2.13(1H，J=13.0，2.5 Hz，H-7a)，1.70(1H，m，H-7b)，1.51(1H，dd，J=13.0，4.5 Hz，H-9)，2.51(1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-11a)，2.22(1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-11b)，6.36(1H，s，H-14)，1.26(3H，s，H-17)，0.90(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-20)，2.06(3H，s，3-OAc)，7.78(2H，m，H-2′，6′)，7.42(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3Cl)δ 37.3(C-1)，23.6(C-2)，80.3(C-3)，37.9(C-4)，55.2(C-5)，19.4(C-6)，40.4(C-7)，80.7(C-8)，51.6(C-9)，36.9(C-10)，17.4(C-11)，99.5(C-12)，163.4(C-13)，98.4(C-14)，158.3(C-15)，164.7(C-16)，28.2(C-17)，20.8(C-18)，16.8(C-19)，15.3(C-20)，171.0(3-O-CO-CH3)，21.4(3-O-CO-CH3)，131.6(C-1′)，125.5(C-2′，6′)，129.0(C-3′，5′)，130.6(C-4′)。上述数据与文献报道化合物[11]数据一致，故化合物被鉴定为phenylpyropene C。

化合物4，白色粉末，ESI-MS:m/z489.3[M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 1.81(1H，m，H-1a)，1.13(1H，m，H-1b)，1.72(1H，m，H-2a)，1.68(1H，m，H-2b)，4.52(1H，dd，J=8.5，3.5 Hz，H-3)，1.13(1H，d，J=4.0 Hz，H-5)，1.81(2H，m，H-6)，2.13(1H，m，H-7a)，1.70(1H，m，H-7b)，1.51(1H，d，J=4.0 Hz，H-9)，4.95(1H，d，J=2.5 Hz，H-11)，6.65(1H，s，H-14)，1.41(3H，s，H-17)，1.68(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-20)，2.04(3H，s，3-OAc)，7.85(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 36.5(C-1)，24.4(C-2)，82.0(C-3)，38.8(C-4)，56.7(C-5)，20.6(C-6)，42.9(C-7)，83.3(C-8)，57.1(C-9)，37.7(C-10)，60.5(C-11)，103.6(C-12)，165.4(C-13)，99.7(C-14)，161.0(C-15)，166.1(C-16)，28.4(C-17)，22.8(C-18)，17.5(C-19)，17.0(C-20)，172.8(3-O-COCH3)，21.1(3-O-CO-CH3)，132.5(C-1′)，126.5(C-2′，6′)，130.0(C-3′，5′)，132.1(C-4′)。上述数据与文献报道化合物[12]数据一致，故化合物被鉴定为phenylpyropene F。

化合物5，白色粉末，ESI-MS:m/z605.3[M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 1.92(1H，m，H-1a)，1.44(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.85(1H，m，H-2b)，4.81(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，1.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-5)，1.70(2H，m，H-6)，4.99(1H，m，H-7)，1.44(1H，m，H-9)，4.97(1H，m，H-11)，6.65(1H，s，H-14)，1.49(3H，s，H-17)，1.75(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，3.80(1H，d，J=12.0 Hz，H-20a)，3.75(1H，d，J=12.0 Hz，H-20b)，2.06(3H，s，3-OAc)，2.13(3H，s，7-OAc)，2.03(3H，s，20-OAc)，7.86(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.1(C-1)，23.9(C-2)，75.3(C-3)，41.7(C-4)，46.6(C-5)，26.1(C-6)，79.9(C-7)，84.3(C-8)，55.6(C-9)，39.1(C-10)，60.3(C-11)，103.6(C-12)，164.1(C-13)，99.4(C-14)，161.2(C-15)，165.8(C-16)，17.9(C-17)，16.8(C-18)，13.5(C-19)，66.0(C-20)，172.6(3-O-CO-CH3)，21.0(3-O-COCH3)，172.4(7-O-CO-CH3)，21.1(7-O-CO-CH3)，172.0(20-O-CO-CH3)，20.7(20-O-CO-CH3)，132.5(C-1′)，126.6(C-2′，6′)，130.0(C-3′，5′)，132.1(C-4′)。上述数据与文献报道化合物[10]数据一致，故化合物被鉴定为phenylpyropene A。

化合物6，ESI-MS:m/z584.4 [M+H]+。白色粉末，1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 2.18(1H，m，H-1a)，1.44(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.87(1H，m，H-2b)，4.81(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，1.62(1H，d，J=5.0 Hz，H-5)，1.74(1H，m，H-6a)，1.68(1H，m，H-6b)，4.99(1H，m，H-7)，1.62(1H，d，J=5.0 Hz，H-9)，4.99(1H，m，H-11)，6.82(1H，s，H-14)，1.49(3H，s，H-17)，1.75(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，3.80(1H，d，J=12.0 Hz，H-20a)，3.75(1H，d，J=12.0 Hz，H-20b)，2.07(3H，s，3-OAc)，2.13(3H，s，7-OAc)，2.03(3H，s，20-OAc)，9.04(1H，d，J=1.5 Hz，H-2′)，8.63(1H，dd，J=5.0，1.5 Hz，H-4′)，7.56(1H，dd，J=8.0，5.0 Hz，H-5′)，8.29(1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.1(C-1)，23.8(C-2)，75.3(C-3)，41.7(C-4)，46.6(C-5)，26.1(C-6)，79.8(C-7)，84.5(C-8)，55.5(C-9)，39.1(C-10)，60.3(C-11)，105.5(C-12)，164.1(C-13)，101.0(C-14)，158.2(C-15)，165.1(C-16)，17.9(C-17)，16.8(C-18)，13.5(C-19)，66.0(C-20)，171.0(3-O-CO-CH3)，21.4(3-O-COCH3)，172.0(7-O-CO-CH3)，21.1(7-O-CO-CH3)，172.6(20-O-CO-CH3)，20.7(20-O-CO-CH3)，129.0(C-1′)，147.3(C-2′)，151.8(C-4′)，125.5(C-5′)，129.05(C-6′)。上述数据与文献报道化合物[13]数据一致，故化合物被鉴定为pyripyropene A。

2.2 化合物抗菌活性

化合物1～6最高浓度(100 μg/mL)对测试细菌菌株均未显示出活性。化合物1～6对于测试的4种真菌菌株活性结果见表1。化合物1，2，4和5对于灰葡萄孢菌具有中等效果的抑制活性(MIC均为50 μg/mL)，化合物6具有较弱的抑制活性(MIC为100 μg/mL)，所有活性化合物只针对灰葡萄孢菌显示抑制活性。

表1 化合物1～6对植物病原真菌最小抑菌浓度(MIC μg/mL)Tab.1 The MIC (μg/mL) of compounds 1～6 for phytopathogenic fungi

3 讨论与结论

Pyripyropene系列物质是从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中分离得到的杂萜类天然化合物，具有良好的特异性抑制胆固醇酰基转移酶(ACAT)活性[13-15]。在筛选杀虫活性化合物时，发现pyripyropene A对刺吸式害虫如蚜虫具有良好的活性，并且显示出独特的药理作用[16]。经过大量的结构改造和构效关系研究，发现化合物的C-3，C-7，C-20位为关键的活性位点，当C-3，C-20位由乙酰基变为环丙甲酰基，C-7位为羟基时，活性提高约80倍，该化合物被命名为双丙环虫酯(afidopyropen)，并成功上市销售[17-18]。在本研究中，发现pyripyropene类化合物具有抗真菌活性，C-15位为苯基时活性要优于吡啶基团，这与杀虫活性的结果不一致[19]；C-7位取代对于抗真菌活性没有影响，不是活性的关键位点。另外，这一类化合物特异性只针对灰葡萄孢菌有活性，表明其可能具有独特的作用机理[19]。植物毒性测试时，200 μg/mL浓度的化合物5和6对于植物(拟南芥、稗草、马唐和反枝苋)种子的萌发和生长没有影响(结果未列出)。深入研究pyripyropene类化合物抗真菌活性的构效关系以及作用机理可以为新的抗真菌先导化合物提供理论依据。

在筛选抗真菌活性菌种时，H-82发酵液的乙酸乙酯提取物显示具有良好的抑制灰葡萄孢菌活性(5 mL发酵液的乙酸乙酯提取物溶解到1 mL乙醇中，将乙醇溶液稀释100倍后仍具有抑制活性)，根据化合物活性测试结果分析，可能分离到化合物存在协同作用或者有显著活性化合物没有被分离到。本次研究分离化合物均首次从Neoascochyta属分离得到，也是首次从青霉属Penicillium和曲霉属Aspergillus以外类群发现产生pyripyropene类化合物，为pyripyropene类化合物生产提供菌种资源；并且首次发现pyripyropene类化合物具有抑制灰葡萄孢菌的活性，在应用该真菌作为活菌制剂时，可能对农作物起到杀虫和杀菌的双重保护功效。