拮抗放线菌F2发酵液的稳定性

2015-10-20蒋桂芳宋力

江苏农业科学 2015年9期

蒋桂芳++宋力

摘要：采用抑制菌丝生长速率法测定放线菌F2发酵液的抑菌活性及发酵液的稳定性。结果发现，F2发酵液对辣椒炭疽病菌有较强的拮抗作用，且在低温贮藏下仍有很好的抑菌效果，在偏酸性或偏碱性条件下稳定，抗热性较差，具有较强的抗紫外线能力，该活性物质在有机溶剂中的分配率较高，为一种酯溶-水溶性抗生素。

关键词：放线菌；发酵液；活性物质；稳定性

中图分类号： S432.4+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0184-02

辣椒炭疽病（Colletotrichum capsici）是危害甜椒、辣椒生产的主要病害之一。目前，辣椒炭疽病的防治主要集中于施用化学农药及抗病品种选育等农业措施，大量化学农药的长期使用导致农药残留、病虫害抗性增加、环境污染等问题，严重影响农业可持续发展[1]。农用抗生素是微生物产生的一类次级代谢产物，可用来杀虫、灭菌、除草及调节作物生长发育的一类微生物农药[2]。随着环境保护、绿色食品及农业可持续发展的需要，农用抗生素以其选择性强、高效低毒、残留短等优点，正日益受到人们的重视。目前，已发现的抗生素中大约有2/3由放线菌产生，从土壤中分离具有农用活性的放线菌是目前微生物农药开发的一个重要途径[3]。本研究从重庆地区的土壤中分离筛选出1株对辣椒炭疽病具较强抑菌活性的放线菌F2，对该拮抗菌发酵液的抑菌稳定性进行研究，以便为该菌株的进一步开发利用提供理论和实践依据。

1材料和方法

1.1供试菌株

拮抗放线菌F2和辣椒炭疽病菌由笔者所在的实验室自行分离保存。

1.2培养基

PDA培养基：用于辣椒炭疽病菌培养及抑菌试验。高氏一号培养基：用于放线菌F2培养。种子培养基：20 g可溶性淀粉，0.5 g K2HPO4，1 g KNO3，0.5 g NaCl，0.5 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，1 000 mL H2O，pH值7.2～7.4。发酵培养基：20 g大豆粉（沸水煮30 min，纱布过滤后保留滤液），10 g蔗糖，5 g可溶性淀粉，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，2 g NaCl，1 g CaCO3，0.5 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，1 000 mL H2O，pH值 7.0。

1.3培养方法

种子液制备：挑取活化菌种F2，接入装有50 mL种子培养基的150 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min下培养48 h作为活化的种子液。发酵液的制备：取1 mL种子液接入装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min条件下振荡培养5 d。将发酵液经粗滤后再经微孔滤膜（0.22 μm）过滤，得到无菌发酵滤液，无菌容器保存备用。

1.4菌株F2发酵液中活性产物的抑菌作用测定

采用菌丝生长速率法[4-5]，以辣椒炭疽病菌为检测菌，测定菌株F2发酵液中活性代谢产物的抑菌作用。将菌株F2的发酵液与PDA培养基按1 ∶3混匀，倒平板，待凝固后将辣椒炭疽病菌菌饼（8 mm）倒置放在平板中央，每处理3次重复，以无菌水和PDA培养液处理为对照。培养96 h后，用“十”字交叉法测量菌落直径，计算抑制率：抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.5F2菌株发酵液性质测定[6-10]

1.5.1热稳定性试验将F2菌株发酵液经40、50、60、70、80、90、100 ℃分别处理30 min，以未处理的发酵液为对照，用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性，重复3次。

1.5.2pH值稳定性试验将F2菌株发酵液用1 mol/L NaOH溶液和l mol/L HCl溶液分别调pH值为3、4、5、6、7、8、9、10，并于4 ℃冰箱中过夜，然后将各发酵液的pH值调回至原发酵液pH值为6.5，以未处理的发酵液为对照，用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性，重复3次。

1.5.3紫外照射对发酵液稳定性的影响将F2菌株发酵液于254 nm紫外灯下分别照射5、10、15、20、25、30 min后，以未处理的发酵液为对照，用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性，重复3次。

1.5.4储藏稳定性试验将F2菌株发酵液在4 ℃和室温（25 ℃）条件下分别保存3、7、15 d后，以未处理的发酵液为对照，用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性，重复3次。

1.5.5活性物质萃取试验取40 mL发酵液分成4份，分别加入等体积的正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚，在磁力搅拌器上搅拌均匀，于分液漏斗中静置过夜。以未处理的发酵液为对照，用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性，重复3次。

2结果与分析

2.1菌株F2发酵液对辣椒炭疽病菌的抑制作用

将拮抗放线菌F2的发酵液与PDA培养基混合制平板，接种辣椒炭疽病菌培养4 d。与对照相比，处理组平板上炭疽病菌株生长缓慢，菌落边缘蔓延不明显，经测定该发酵液的抑菌率达到81.81%（图1）。以上结果表明，F2发酵液对辣椒炭疽病菌丝生长有显著的拮抗作用。

2.2温度对稳定性的影响

随着处理温度升高，F2发酵液的抑菌活性缓慢下降，与对照比较，在70 ℃条件下抑菌率为60%以上，但70 ℃后发酵液的抑菌效果明显降低，90 ℃处理后抑菌率降低到27%（图2）。以上结果表明，F2发酵液中生物活性物质热稳定性较弱，高温会对其活性造成严重影响。

2.3pH值对稳定性的影响

在室温下F2发酵液中活性代谢产物在酸性条件下抑菌活性较稳定，pH值在3～5范围内，发酵液活性代谢产物的抑菌活性与对照发酵液相近，稳定性较好。随着碱性增强，抑菌率呈下降趋势，但幅度不大，pH值在10下依然保持着较强的抑菌活性，抑菌率为72.7%（图3）。因此，F2发酵滤液pH值在3～10范围内，对酸碱具有较好的稳定性，但要注意控制pH值范围，以尽量减少活性成分的损失。

2.4紫外照射对稳定性的影响

在紫外线照射5～30 min的情况下，随着紫外线照射时间的增长，活性物质的抑菌率有下降趋势，经过半个小时照射，活性物质的抑菌率为63.6%，与对照比较下降幅度小于5%（图4）。以上结果表明，该菌株发酵液中活性代谢产物对紫外线不敏感，有较强的抗紫外线照射的能力，可以用紫外光适当照射发酵液来杀灭杂菌。

2.5储藏时间对稳定性的影响

在室温与冷藏条件下活性物质抑菌率都呈下降趋势，但冷藏条件下抑菌率下降缓慢，经15 d储藏后抑菌率为7272%，其抑菌活性变化均不明显。而室温条件下储藏3 d时活性明显降低，经过15 d储藏后抑菌率为63.6%，与对照相比下降了9.09百分点（图5）。以上结果表明，F2发酵液中活性代谢产物储藏稳定性较好，且低温储藏效果更好。

2.6不同有机溶剂对活性物质萃取的影响

活性物质在原始pH值条件下能被三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚及正丁醇萃取，且萃取效果较明显，大部分抑菌活性物质都进入到有机相中，只有石油醚萃取活性物质能力较弱（表1）。根据相似相溶原理，可大致判断该活性物质极性较强。此外，该活性物质既能溶于溶媒又能溶于水，是一种酯溶-水溶性抗生素，且乙酸乙酯、正丁醇的萃取效果比三氯甲烷和石油醚的效果好。

1发酵上清液萃取试验结果

萃取溶剂生长抑菌率（%）水相有机相三氯甲烷18.1977.27乙酸乙酯63.6381.81石油醚81.8127.28正丁醇54.5581.813结论

菌株F2发酵液中的活性物质对辣椒炭疽病菌有很好的抑制作用，菌丝生长抑制率达到80%以上，对用于防治辣椒炭疽病具有较高潜在价值。

菌株F2发酵液活性物质对高温的稳定性差，对酸碱具有较好的稳定性，有较强的抗紫外线能力，耐低温贮藏。

菌株F2发酵液经初步处理，采用有机溶剂进行萃取活性物质在有机溶剂中的分配率较高，是一种酯溶-水溶性抗生素，可进一步分离纯化应用于辣椒炭疽病的生物防治。

参考文献：

[1]蒋桂芳，宋力. 辣椒炭疽病生物防治技术的研究与展望[J]. 湖北农业科学，2014，53（11）：2481-2484，2485.

[2]朱昌雄，宋渊. 我国农用抗生素的现状与发展趋势探讨[J]. 中国农业科技导报，2006，8（6）：17-19.

[3]沈寅初. 农用抗生素研究开发新进展[J]. 植保技术与推广，1997，19（6）：35-37.

[4]张玲玲，董美玉，许凤春，等. 放线菌C3-11的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究[J]. 现代农业科技，2009（3）：109-110，113.

[5]黄剑，李天华，崔艺久，等. 放线菌H50发酵液抑菌活性及其稳定性测定[J]. 沈阳农业大学学报，2012，43（3）：311-315.

[6]于银霞. 168号放线菌发酵产物的分离提取和活性研究[D]. 北京：首都师范大学，2009.