响应面法优化S2菌株的培养条件

刘江红等

摘要：利用快速筛选方法从大庆采油三厂油田采出水中筛选出高产生物表面活性剂菌株S2，经鉴定为芽孢杆菌属.对S2菌株产生的生物表面活性剂进行提取及纯化后，通过离子鉴别实验及红外光谱法对其进行定性检测，确定其种类为非离子型脂肽类.以菌种S2产生的发酵液的乳化指数（E24）为指标，通过响应面优化方法对S2菌株的培养条件进行优化，以接种量、pH值、温度、摇床转速为因素优化对象进行实验.在此模型的基础上，通过二次回归方程得出最佳值是pH为7.2、温度为43.5 ℃ 、接种量为5.2%（V/V）、摇床转速为162 r/min.在优化后的最佳培养条件下，测得菌株S2所产生发酵液的最优E24为81.20%.

关键词：发酵液；红外光谱法；响应面实验；乳化；菌株

中图分类号：TE357 文献标识码：A

Abstract：S2 strain that highly produces biosurfactant was screened from the oilfield water of three plants in Daqing Oilfield in the rapid screening method， and the S2 strain was identified as Bacillus sp.. Through FTIR and ion identification test， S2 biosurfactant was identified as nonionic lipopeptide biosurfactant. This experiment treated emulsification index （E24） of S2 strain fermentation broth as the object. Through response surface optimization method， the culture conditions （inoculum， pH， temperature and rotation speed） of the S2 strain were optimized. On the basis of response surface model， the optimum pH value was 7.2 and the temperature was 43.5 ℃， inoculation of 5.2% （V/V）， rotation speed was 162 r/min through the quadratic regression equation. Under the optimal condition， the best E24 of S2 strain fermentation broth was 81.20%.

Key words： fermentation broth； infrared spectral measurements； response surface experiments； emulsification； strain

生物表面活性剂是微生物在一定条件下发酵产生且具有表面活性的次级代谢产物，其性质为同时具有亲油性和亲水性[1].生物表面活性剂对疏水性物质具有有效的乳化、润湿、分散、溶解作用，同时使体系的表/界面张力有所下降[2-3].自然界中存在许多微生物（细菌、真菌等），这些微生物能够在发酵培养过程中分泌产生不同种类的生物表面活性剂.现在化学合成的表面活性剂因其造成环境污染而使其使用面临着巨大的环境压力，生物表面活性剂具有功能的多样性和对环境的友好性，且在食品工业、原油采出、污染环境的修复等领域中起着越来越重要的作用.

作为一种综合性优化方法，响应面优化法结合了数学方法和统计学方法，主要内容包括优化实验设计、响应曲面分析和拟合优化计算3部分，被广泛地应用在微生物培养条件优化和生化反应中[4].本实验通过BoxBehnken响应面设计的应用对生物表面活性剂高产量菌株S2的发酵培养条件进行优化，以乳化指数E24为响应值，pH值、温度、接种量及摇床转速为其主要影响因素，通过实验后得到的数据并分析各因素的最佳条件，从而提高乳化指数.通过对本实验模型的3D响应曲面图和等高线图的分析，可以直观地得出各因素与乳化指数E24的响应关系及各因素间交互作用的显著程度[5-6].采用DesignExpert 8.0.5软件进行实验设计、数据处理及模型建立.

1 材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1主要设备

XZD3型界面张力仪，上海平轩科学仪器有限公司；超声细胞破碎仪，赛飞（中国）有限公司；薄层色谱层析缸（100×100），天津市思利达科技有限公司 ；红外光谱仪，大塚电子（苏州）有限公司.

1.1.2菌株来源

以快速法为筛选方法，从大庆采油三厂的油田采出水中筛选出高产生物表面活性剂纯菌种S2，经实验室一系列生理、生化实验鉴定后，确定S2菌种为芽孢杆菌属（Bacillussp.）.

1.1.3培养基

发酵培养基（g/L）：葡萄糖20 g，mNaNO3=0.5 g，mKH2PO4=1 g，mNa2HPO4=2 g， mMgSO4=0.02 g，mFeSO4=0.01 g，mNaCl=5 g，mCaCl2=0.08 g，pH值为7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min.

1.2实验方法

1.2.1发酵液的乳化指数（E24）测定[7]

将经过72 h震荡培养后的发酵液用离心机去除菌体细胞，取其5 mL和5 mL液体石蜡混合于比色管中，在100 W的超声波中进行细胞粉碎处理，待形成白色乳化液后，静置24 h，测量E24的公式如式（1）所示.