基于万古霉素荧光探针的原位标记及应用

黄亚妮 陈代杰 殷瑜,*

(1 上海师范大学生命科学学院，上海 200030；2 上海交通大学药学院，上海 200240)

病原菌一直是人类健康的主要威胁。传染病每年造成大约100万人死亡，占全球死亡率的三分之一[1]。而随着抗生素的不断使用，耐药菌不断出现[2]。因此，快速精确诊断病原菌、寻找新的抗生素，并对抗生素的作用机制以及细菌与人体相互作用机制的研究迫在眉睫。荧光抗生素探针作为一种新的研究工具，使得药物及其与细菌靶点的相互作用能够在细胞器、细胞及动物水平中被示踪[3]。万古霉素是由东方拟无枝酸菌产生的含七肽的糖肽类抗生素，可有效与细菌细胞壁中的D-丙氨酰-D-丙氨酸部分特异性结合，能特异性地抗革兰阳性菌，是临床上治疗由金黄色葡萄球菌引起的严重感染的首选药物[4]。万古霉素已在临床上应用了50多年，对其药代动力学、生物分布和毒性特征有着广泛的了解。从结构上看，万古霉素具有与荧光剂共价结合的伯胺基团，从而可形成荧光探针，作为光学成像剂在体内选择性靶向革兰阳性菌。本文将对荧光标记万古霉素技术及其在细菌临床感染诊断、药物作用机制研究、药效研究等方面的应用进行综述。

1 荧光标记万古霉素技术

理想的荧光标记的抗生素不应改变与细胞靶点的结合或药物的药动学，因此荧光标记试剂的选择至关重要。

1.1 FITC标记万古霉素

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)是一种量子产率高的荧光染料。其最大激发/发射波长在492/525 nm左右。当分子中含有化学反应活泼的异硫氰基(-NCS)时，在适当条件下，它易与蛋白质氨基酸的N端残基形成共价键[5-7]。用FITC标记万古霉素，可获得既能保持FITC荧光特性、又能保持万古霉素与细菌胞壁结合能力的标志物。类似异硫氰酸的荧光素还有羟基荧光素(craboxyfluorescein,FAM)，四氯荧光素(tetrachlorofluorescein,TET)。但荧光素类衍生物有共同的缺点：光淬灭率高、pH敏感性强和发射波谱宽等[8-9]。

1.2 罗丹明类荧光试剂

罗丹明类是一种标准荧光素的衍生物，主要包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(craboxytetramethylrhodamime,TAMRA)等，其结构中的-SO2X、-NCS为活性基团。万古霉素与罗丹明的标记反应中，罗丹明的活性基团与万古霉素C端羧基结合[10]。与FITC等荧光素类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性、更高的荧光产量及更低的pH敏感性。

1.3 硼二吡咯甲基乙烷

硼二吡咯甲基乙烷(BODIPY)是最常用的荧光染料。BODIPY的光谱峰宽较窄，检测灵敏度高，其光稳定性能十分优越，而且该染料在水溶液中溶解度较高，在水中不易被淬灭。万古霉素和BODIPY的荧光素衍生物已被用于研究枯草芽孢杆菌中肽聚糖的生物合成过程[11]。

1.4 荧光无机纳米颗粒

近年来，荧光无机纳米颗粒由于克服了荧光试剂不稳定、容易淬灭等缺点，得到了广泛的关注。Sun等[12]采用两步法制备了万古霉素和对苯二甲酸酯(TA)共修饰的掺杂铕的双氢氧化物(Van-TA-Eu-LDHs)纳米颗粒，可以选择性地荧光标记细菌。Zhang等[13]用一种红色染料(DyLightTM)标记了万古霉素明胶纳米球，其生物相容性、生物降解性和分析灵敏度比传统的万古霉素荧光标记法具有很大的优势。纳米荧光具有激发光谱宽、分布连续、发射光谱对称分布且宽度窄、颜色可调等优点。万古霉素的荧光纳米颗粒在生物分子标记、细胞成像等生物领域有着广泛的应用前景。

1.5 其他荧光物质

IRDYE800CW荧光素是一种近红外荧光染料，与万古霉素糖基上的-NH2结合为一种荧光探针，具有极为显著的穿透深度和分辨率，因此该荧光标记物可用于生物荧光成像技术，在探寻细菌感染诊断等方面具有重要的实践意义和应用前景[14]。二苯甲酮光交联剂作为一种荧光剂可与万古霉素游离的C端羧基结合成为一种新型探针[15]，其价格低廉，在常用溶剂中溶解性较好，最大吸收波长和中压汞灯的发射波长匹配，但是熔点较低，在升温时容易因挥发而造成损失[16-17]，该探针可用于万古霉素作用机制的研究。

荧光试剂的种类不同，标记方法各有差别，但所要求的条件和步骤大致相同。影响标记的因素有温度、pH值及反应液中荧光试剂比例等。以上几种荧光试剂标记方法的比较见表1。

表1 万古霉素荧光标记方法的比较Tab.1 Comparison of fluorescent labeling methods forvancomycin

2 万古霉素荧光探针的应用

荧光万古霉素已用于病原菌的检测、细胞壁合成机制、毒性、和药效学研究等方面[3](图1)。

图1 荧光标记万古霉素及其应用Fig.1 Fluorescent labeling of vancomycin and its applications

2.1 细菌感染的检测

病原菌的诊断和耐药菌的检测对临床用药具有重要的指导意义。传统的细菌检测方法，如培养基培养技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)分析等，存在耗时长、灵敏度低、过程繁琐等缺点，需要密集细致的样品制备和熟练的技术人员[18]。如今放射性核素成像技术已经成为检测细菌感染的成像主要手段，但其主要的问题是无法区别细菌的类型以及无法排除炎症的影响[19-20]，为细菌感染的体内成像开发特定的成像探针可有效解决这些问题[21-23]。

2.1.1 体内病原菌的快速诊断

细菌的快速分型(革兰阳性菌或革兰阴性菌)是临床选择抗生素种类的重要依据。荧光标记抗生素作为一种简单且易于控制的方法，已成为许多生物学研究中不可或缺的工具，可以对细菌进行简单、快速、灵敏和选择性的鉴定[21]。Yang等[10]设计了一种万古霉素和罗丹明修饰肽衍生物(Rho-FF-Van)作为荧光显像剂，随后，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)与探针共培养后通过透射电镜可观察到Rho-FF-Van处理的MRSA外膜有明显的纳米聚集体。利用患有肌炎的小鼠，往其左后腿上注射MRSA，右后腿上注射Escherichia coli，注射荧光万古霉素后2 h内，荧光成像观察，发现Rho-FF-Van在MRSA感染的大腿肌肉中的蓄积量是E.coli感染的8.7倍(图2a)，与对照组织相比，感染MRSA的大腿肌肉中Rho-FF-Van的蓄积量增加了3.9倍(图2b)。证明了万古霉素对小鼠体内革兰阳性菌MRSA的作用更敏感。Van Oosten等[14]也证明用IRDYE800CW标记的万古霉素，在小鼠大腿肌肉中可区分革兰阳性菌S.aureus的和革兰阴性菌E.coli的感染(图2c)。在人的尸体中，将S.aureus注入皮下，随后，注射荧光万古霉素成像。同样可以明显识别出含有荧光细菌的斑点(图2d)。由此可见，万古霉素荧光探针可有效用于病原菌的原位标记及快速诊断。

图2 万古霉素荧光标记化合物在动物中的成像Fig.2 Image of vancomycin fluorescently labeled compounds in animals

2.1.2 万古霉素耐药菌的检测

对于菌株对万古霉素敏感性的检测，传统方法有稀释涂布平板法和PCR扩增等，这些方法耗时长，不适用于大量样本的检测。本实验室前期采用FITC标记的万古霉素，通过荧光分光光度计和流式细胞仪(FCM)法，建立了菌株对万古霉素耐药性的快速检测方法。结果显示万古霉素荧光标记物对其敏感菌(Enterococcus faecalis,S.aureus)表现出很强的特异性，其荧光强度明显高于对万古霉素不敏感的细菌如革兰阴性菌E.coli和耐万古霉素肠球菌(VRE)，该探针可用于检测细菌对万古霉素的耐受性[24]。

2.2 万古霉素给药系统的改善

生物材料相关感染和骨髓炎等感染通常与细菌(如S.aureus)的存活有关。由于许多抗生素的体内效力较低，治疗这些感染仍然是一个主要的挑战。因此，迫切需要局部给药系统，以提高抗生素的细胞内给药效果[25-26]。

将荧光标记的万古霉素明胶纳米微球悬浮液注射到斑马鱼幼体的尾肌组织中[13]，24 h后，在体内和体外均能观察到巨噬细胞对万古霉素明胶纳米微球的内化作用。而注射无明胶纳米球载体的游离万古霉素后，万古霉素和斑马鱼巨噬细胞几乎没有发生内化作用。结果显示，明胶纳米球作为万古霉素的载体，可以提高万古霉素的局部给药能力，增强万古霉素的抗菌活性。

2.3 作用机制的研究

2.3.1 万古霉素及其衍生物作用靶点的研究

万古霉素已在临床上应用了50多年，但是万古霉素及其类似物的作用靶点仍有一些未知。荧光标记万古霉素药物可以直接与细菌靶点相互作用，观察方便，有利于万古霉素的作用机制进一步研究。

为了深入了解万古霉素对S.aureus和E.faecalis作用的相关靶点，Eirich等[15]用二苯甲酮光交联剂与万古霉素结合成小分子的光亲和探针。用不同浓度的探针处理细菌，裂解细菌后通过荧光SDS凝胶，进行蛋白质组分析，发现了两个先前未知的万古霉素作用靶点葡萄球菌自溶素(ATL)和ABC转运体蛋白，万古霉素可直接靶向葡萄球菌自溶素(ATL)酰胺酶的结构域，导致S.aureus细胞壁被破坏，同时也增强了金黄色葡萄球菌对低浓度万古霉素的耐受性。此外，在E.faecalis中，万古霉素光可与ABC转运体蛋白特异性结合，从而阻碍细菌对糖和肽等必需营养素的摄取。

2.3.2 肽聚糖生物合成的机制研究

细菌细胞周围的肽聚糖(PG)层在决定细胞形状方面起着重要作用。PG的合成涉及细菌肌动蛋白同源物(如在细胞内形成螺旋电缆的Mbl)和细胞外多蛋白复合物(如青霉素结合蛋白)之间的相互作用，而何时何地、如何调控，机制尚不清楚。采用荧光素标记的万古霉素探针(Van-FL)与PG前体结合，并以作用于细菌转肽酶的雷莫拉宁荧光素探针(Ram-FL)作为对照，比较了在枯草芽孢杆菌中观察到的两种PG结合荧光抗生素的染色模式[27]。结果显示雷莫拉宁和万古霉素探针沿着枯草芽孢杆菌细胞壁产生螺旋状染色图案，证明PG是以螺旋状的方式合成的。

2.3.3 细菌对万古霉素耐药机制的研究

利用荧光标记的万古霉素(BODIPY-FL-万古霉素)可以发现，在使用万古霉素治疗期间获得的分离菌株，对万古霉素敏感性降低与细菌的药物结合力增加、细胞壁周转率降低以及Triton X-100自溶敏感性降低直接相关[11]。这支持了万古霉素中度耐药性金黄色葡萄球菌(VISA)表型在体内发展的概念，即细菌通过细胞壁的增厚建立了“抗生素捕捉”机制，最终阻止万古霉素扩散，使细菌产生耐药性。

2.3.4 清除生物膜作用机制的研究

S.aureus除了是引起感染的主要致病微生物之一外，大部分由S.aureus导致的感染与细菌生物膜的形成有关。生物膜是密集的微生物群落，附着在有生命或无生命物体表面，并进一步分泌主要由水、多糖和蛋白质组成的胞外基质，生物膜的形成会使细菌发生生理变化，导致生物膜内的菌体出现耐药性[28-29]。

研究发现，利福平与万古霉素联用，具有协同清除生物膜的作用。利用BODIPY-FL-万古霉素荧光标记物通过荧光漂白后恢复技术(FPAP)，可在共聚焦显微镜下动态观察荧光抗生素在S.aureus生物膜内的渗透率[30]。研究结果显示，单独用万古霉素和利福平治疗时，细胞损伤率较低。当利福平与万古霉素联用时，随着时间的推移，细胞损伤明显增加。同时发现二者联用时，荧光万古霉素与利福平相互作用形成复合物，并能快速渗透入生物膜，使两种药物与各自靶点结合，协同致死菌膜内的菌体，从而清除生物膜。

3 总结与展望

过去的几十年中靶向成像在癌症治疗中相对成功，但细菌感染靶向成像探针的开发研究很少，目前还没有针对性的细菌成像方法用于临床常规诊断，而利用荧光进行标记分析的发展特点是趋于更简便、更灵敏、更稳定、更安全以及更好的选择性等。

荧光抗生素探针的研发，可以用于耐药菌的快速检测，进一步用于耐药细菌的机制研究和不同细菌的敏感性测试，并且指导抗生素合理的使用，以解决如今日益严重的细菌耐药性问题。未来的荧光标记技术也会克服如今存在的一些潜在的局限性，例如稳定性低、低深度穿透和不可避免的组织自荧光。