疏肝温胆汤对机动车尾气诱导大鼠血管内皮损伤的作用

赵帅 陈燕虹 庄杰钦 高焕佳 蔡海荣 陈伯钧

(广州中医药大学 1第二附属医院，广东 广州 510120；2第二临床医学院)

现今，我国雾霾天气日益严峻，不仅影响了生态环境，还对人体的健康造成了威胁〔1～3〕。而PM2.5(颗粒物粒径动态直径<2.5 μm)作为雾霾天气的罪魁祸首〔4〕，其主要来源有燃煤、机动车尾气排放、工业生成过程及其他排放源(地面扬尘、溶剂挥发、植物、农业及生物质的燃烧等)〔5〕。长期暴露于PM2.5环境中会导致血管内皮功能受损从而加速动脉粥样硬化(AS)的发展〔6〕。内皮功能的损伤与AS的发病机制息息相关，内皮受损可使平滑肌细胞增生、脂质沉积、白细胞黏附、粥样斑块脆性增多与破裂，引起血栓形成，是引发心血管疾病共同的生理病理基础，引起AS形成的关键。因此，对内皮功能的紊乱采取干预措施，已然是防治AS的紧要环节。

炎症反应是引起血管内皮功能损伤的重要机制，而核转录因子(NF)-κB信号通路在炎症中起着极其重要的作用，其下游主要因子为肿瘤坏死因子(TNF)-α。肝X受体(LXR)α具有调节脂质代谢及炎症反应的作用，还可以影响TNF因子。本研究以吸入机动车尾气作为暴露于雾霾的一种手段，通过制备相关空气污染的动物模型，以炎症通路为干预靶点，探讨疏肝温胆汤对动脉血管内皮损伤的影响及可能机制，为中医药治疗血管内皮损伤提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 LXRα、TNF-α、NF-κB用Primer Premier5软件设计；戊二醛磷酸缓冲液；全自动生化分析仪；Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P；JEM-2000EX型透射电镜；离心机等均由广州医科大学实验室提供。

1.2动物 从广东省医学实验动物中心购入雄性健康成年SD大鼠20只，体重约130 g，许可证号：SCXK(粤)2013-002，生产批号：44007200038004。

1.3实验药物的制备 疏肝温胆汤(陈皮15 g、竹茹12 g、半夏10 g、枳实15 g、甘草6 g、茯苓20 g、柴胡12 g、白芍15 g、丹参15 g)，药物批号：161102201，以上药材均由广东省中医院中药房提供，按成年人60 kg体重剂量的4倍水煎浓缩至含生药1.24 g/ml，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.4暴露及干预方式 将暴露组和药物组置于机车尾气暴露房，关闭暴露房，打开机车开关，拧动引擎5 min，后关闭开关，打开暴露房内的小电扇使暴露均匀，如此暴露6 h后搬出动物，药物组用疏肝温胆汤按照1 ml/100 g的比例进行灌胃。如此暴露及干预2个月。对照组饲养于实验室过滤空气环境。

1.5C反应蛋白(CRP)水平测定 于2个月干预结束时，动脉采血5 ml，以4℃ 3 000 r/min离心15 min后取上层血清，用生化分析仪检测CRP水平。

1.6组织病理学观察 采血结束后，立即开胸取主动脉约2 cm，用戊二醛磷酸缓冲液固定，不超出3 d，经磷酸缓冲液冲洗，用1%锇酸加0.8%铁氰化钾固定，再经磷酸缓冲液漂洗，行梯度丙酮脱水，包埋，聚合。先制成半薄切片，用光镜观察定位于血管内膜部位。然后切成70～80 nm的超薄切片，置于附有支持膜的铜网上，用5%的水性醋酸铀染色，再用枸橼酸染色5 min后用透射电镜观察并拍照。

1.7采用RT-PCR检测肝脏组织内LXRα、TNF-α、NF-κB的mRNA表达水平 收集肝脏组织，提取组织RNA，紫外分光光度计测定组织RNA分别在280nm和260nm处的吸光度值(OD)，并计算RNA的含量及纯度。从组织总RNA逆转录合成总cDNA，然后稀释探针及引物，依次加入每管中，用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P 94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃ 20 s，40个循环，记录结果。检测基因的序列、产物长度见表1。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、方差分析、秩和检验、χ2检验、多因素重复测量方差分析。

表1 PCR 引物序列及产物片段长度

2 结 果

2.1药物对LXRa、TNF-α、NF-κB的mRNA表达水平的影响 暴露组肝脏LXRa mRNA水平较对照组显著下降，肝脏内NF-κB、TNF-α mRNA水平较对照组显著升高(P<0.05)。药物组肝脏LXRα mRNA水平较暴露组显著升高，肝脏NF-κB、TNFα mRNA水平较暴露组显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 各组TNF-α、LXR-α、NF-κB mRNA表达

2.2CRP水平 暴露组CRP水平较对照组显著升高〔(0.48±0.08)mmol/L vs (0.20±0.08)mmol/L〕，而药物组CRP水平〔(0.27±0.15)mmol/L〕较暴露组显著下降(均P<0.05)。

2.3组织病理学检测

2.3.1苏木素-伊红(HE)染色观察 对照组：血管内皮细胞呈梭形，结构较完整，排列较整齐，大小较一致。暴露组：血管内膜增厚，内皮细胞减少，结构不完整，排列紊乱，中可见较多中性粒细胞(黑色箭头所指)。药物组：内膜未见明显增厚，细胞结构及排列尚规整，未见炎症细胞。见图1。

2.3.2扫描电镜观察 对照组：内皮完整，内皮细胞呈梭形，排列交错，细胞间紧密连接。暴露组：内皮细胞收缩，细胞间隙增大，部分内皮细胞脱落，形成脱失区中可见较多泡沫细胞及炎症细胞(黑色箭头指代炎症细胞浸润，红色箭头指代泡沫细胞)。药物组：内皮尚规整，细胞间连接较疏松，未见细胞间隙开大及内皮细胞崩解。见图2。

图1 各组胸主动脉组织病理学(HE染色，×100)

图2 各组胸主动脉扫描电镜

3 讨 论

血管内皮功能的损伤与AS的发生发展直接相关，内皮损伤已成为心血管病发病的独立危险因素〔7,8〕。炎症反应是内皮损伤的主要机制，单核/巨噬细胞激活、渗出、分化和泡沫细胞的形成是AS斑块典型的特征。目前研究证明，炎症因子直接参与AS的形成〔9,10〕。hs-CRP可使炎症细胞向血管内皮迁徙，使单核、淋巴细胞激活，使AS发展〔11〕。可激活NF-κB是促炎症基因表达的关键，NF-κB 通过促使局部炎症和细胞因子转录的增强，使白细胞及黏附因子的表达增加，使中膜平滑肌细胞向内膜迁徙，单核细胞堆积、浸润，从而导致AS形成〔12〕。在刺激因子的诱导下，NF-κB活化后可调控一些基因的表达，而前炎症性细胞因子TNF-α是NF-κB通路重要的下游调控因子〔13〕。TNF-α因子能够诱导白细胞介素(IL)-6、IL-10等炎性细胞的释放，损伤血管内皮。LXR表达于巨噬细胞，是胆固醇在斑块中代谢的重要的信号通路〔14〕。研究发现LXR不仅参与调节胆固醇的逆转运，而且在炎症调控方面起关键作用。LXR具有抗炎的作用，可以通过对炎症因子表达的调控，参与机体炎症反应的调节〔15,16〕。巨噬细胞在炎症及免疫反应中起到至关重要的作用，能被内毒素通过 Toll 样受体(TLR)4通路激活释放炎症介质，其中内毒素主要为革兰阴性杆菌细胞壁中的脂多糖(LPS)成分。在人体中，LXR可以增加TLR4的表达，并增强TLR4对LPS的反应性〔17〕。而且LXR的激活对经由TLR4通路增强的免疫炎症反应起着允许作用〔18〕。有研究提及 LXRs 的激动剂能压制一些炎症因子表达，其中包括：TNF-α、CRP等〔19〕。LXR 激动剂作用于人单核巨噬细胞，可抑制TNF-α在核酸和蛋白质水平上的表达，起到保护血管内皮功能的作用〔19〕。LXR具有调节体内生理活动和基因的作用〔20〕，目前已知LXR有两种同源亚型:LXRα和LXRβ，其中LXRα是一种核受体〔21〕，在与脂代谢紧密相关的组织如肺、脂肪组织、小肠、肾上腺、肾和巨噬细胞中高度表达，但在肝中含量最丰富。本研究结果说明疏肝温胆汤在抑制炎症方面发挥显著疗效。

疏肝温胆汤是陈伯钧教授治疗AS的经验方，由温胆汤和柴胡疏肝散化裁而成，全方共七味药物，具有化痰祛瘀、疏肝理气的功效。疏肝温胆汤可以使AS患者的症状得到改善。前期实验研究表明疏肝温胆汤能够使血脂水平降低，AS斑块面积缩小、动脉硬化程度减轻，且已证实疏肝温胆汤可以使LXRα的表达上调。疏肝温胆汤中柴胡疏肝解郁以理气和肝胆；芍药柔肝养阴；竹茹清热化痰，止呕除烦；法半夏燥湿降逆以和胃；茯苓健脾渗湿；枳壳、陈皮行气导滞以疏通气机；川芎活血化瘀，行气止痛以通达肝脾；甘草和中缓痛。诸药共济，合以法畅。此方以疏肝理气为主，兼以养肝，调血和胃。临床上应用疏肝理气方药能改善血管内皮功能〔22〕，疏肝的方法也能改善血脂状况〔23〕，疏肝理气要药柴胡有抗炎、抗氧化、稳定细胞膜、抑制血管通透性增加等作用〔24〕。因此，疏肝解郁、调理气机对于AS的预防及其引发的心脑血管病有多方面的作用机制。

综上，在对机动车尾气诱导所致血管内皮损伤的大鼠中，应用疏肝温胆汤进行干预能取得令人满意的效果，可以明显降低机车尾气对血管内皮造成的影响，改善血管内皮损伤，升高肝脏LXRα水平，降低肝脏NF-κB、TNFα、血清CRP，这为心血管内皮损伤疾病的中医治疗方面提供了一定的思路和理论基础。但本实验中样本量较少，需扩大样本量以进一步研究。