大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

刘 倩，韩陈陈，罗婷婷，张 雨，李 浩，马 旸，魏 伟

根据血管的结构、功能和运输方向差异，分为动脉、静脉和毛细血管。血管壁作为血液与组织的边界，由内膜、中膜和外膜构成。内皮细胞主要存在于内膜层，在生理条件下释放一氧化氮(NO)、前列环素2(PGI2)和内皮素(ET)，有助于松弛血管张力并调节血管对血浆成分和血小板的渗透性。中膜层由平滑肌细胞组成，可支持内皮细胞并诱导血小板黏附和聚集。外膜层由结缔组织组成，是血管与组织之间的边界。

目前已有人、鼠、兔、犬等大血管内皮细胞的分离培养方法，但关于大鼠较小血管如股动脉原代内皮细胞分离、培养方法及功能研究鲜有报道。大鼠股动脉位于腹股沟耻骨联合处，管径窄小，分离其原代内皮细胞有一定难度。所以，探索一种简便可行的提取、分离、培养方法十分必要。该研究综合股动脉生理特性与血管内皮细胞生长需求，制备出一种有效、简便的内皮细胞分离与培养方法，并对其进行了鉴定和功能研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取7～8周龄SPF级雄性Wistar大鼠，并饲喂于安徽医科大学SPF级实验动物中心。温度：20～26 ℃；日温差：≤4 ℃；相对湿度：40%～70%。实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(北京)2016-0006。该实验在处理动物过程中遵循安徽医科大学实验动物伦理章程。

1.2 试剂

DMEM /F12 基础培养基、完全培养基、胎牛血清及PBS均购自以色列Biological Industries公司；胰酶(含EDTA)、青霉素-链霉素抗菌溶液、DAPI 染色液及防荧光淬灭封片液均购自上海碧云天生物技术研究所；CD31抗体购自美国GeneTEX公司；荧光抗体购自美国Proteintech公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；PGE2购自美国Cayman公司；TritonX-100购自中国Biosharp公司；基质胶(Matrigel胶)、Transwell小室均购自美国Corning公司；结晶紫购自北京索莱宝生物公司。

1.3 主要仪器

-80 ℃超低温冰箱：美国SANYO 公司；Cyto FLEX 型流式细胞仪：美国 Beckman Coulter 公司；BD FACSAria 分选型流式细胞仪：美国BD公司；BX-50型倒置显微镜：日本 OLYMPUS 公司；BX-53正置显微镜：日本 OLYMPUS 公司；2306-2 型 CO培养箱：美国SHEL LAB 公司；Image Xpress Micro 4型高内涵细胞成像分析仪：美国 Molecular Devcies 公司；Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜：德国Leica公司。

1.4 大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离

取7～8周龄雄性Wistar大鼠，注射2%戊巴比妥钠处以安乐死，无菌打开耻骨联合处分离股动脉；加入PBS清洗并除去血管上黏连的脂肪和结缔组织；剪碎血管，4 ℃、4 000 r/min离心5 min；加入1 ml胶原酶Ⅳ消化液，37 ℃、200 r/min消化1.5～2 h；200目筛网过滤组织块，离心并加入完全培养基重悬接种于T 25细胞瓶，置于37 ℃、5% CO培养箱培养。

1.5 大鼠股动脉血管原代内皮细胞形态学观察

用倒置显微镜对培养的原代股动脉血管内皮细胞进行观察，并拍照记录。

1.6 大鼠股动脉血管原代内皮细胞传代培养

原代细胞培养14～16 d，镜下观察到细胞覆盖面积达到2/3以上即可传代。加入含EDTA的胰蛋白酶消化细胞；当细胞萎缩变圆即加入DMEM/F 12培养基终止消化；离心并加入适量培养基制备细胞悬液：1 ∶2或1 ∶3进行传代培养。

1.7 大鼠股动脉血管原代内皮细胞纯度检测

将消化所得细胞4 ℃、2 000 r/min离心10 min;重悬后与加入CD31抗体孵育30 min；离心并加入适量PBS重悬；流式细胞术检测内皮细胞比例。

1.8 分选和培养股动脉血管原代内皮细胞

加入胰蛋白酶消化细胞，以DMEM/F 12终止消化，移至15 ml无菌离心管；4 ℃、1 500 r/min离心5 min，以适量PBS重悬细胞；CD31抗体孵育1 h；加适量PBS，离心并以PBS重悬；分选所得细胞置于37 ℃、5% CO培养箱培养。

1.9 激光共聚焦检测股动脉血管原代内皮细胞中CD31的表达

以4%多聚甲醛固定细胞30 min；加0.5% Triton通透15 min；0.5% BSA封闭30 min；洗涤后即加入抗体CD31；4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后加入荧光抗体；避光孵育2 h；加DAPI染核，结合5 min；用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况。

1.10 股动脉血管原代内皮细胞功能实验

1.10.1

细胞增殖实验

1.10.1.1

CCK-8检测法 胰蛋白酶消化细胞，以DMEM/F12终止消化并制备悬液；加入96孔培养板；培养6 h，加0.3 μmol/L PGE；37 ℃、5% CO培养箱中孵育48 h；PBS洗涤细胞；每孔加CCK-8继续培养；2～4 h后，以酶标仪检测其吸光度(450 nm处)。

1.10.1.2

高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖实验 内皮细胞以每孔5×10密度接入96孔板中，加入0.3 μmol/L PGE预处理48 h，终止培养前，用 PBS清洗细胞；多聚甲醛固定30 min，加DAPI溶液结合5 min；加适量PBS并用高内涵细胞成像系统拍照。

1.10.2

内皮细胞Transwell迁移实验 内皮细胞接种于24孔板；加入0.3 μmol/L PGE刺激48 h；消化细胞并将Transwell小室放入24孔板中；在下室中加入DMEM/F12培养基，上室加细胞悬液；37 ℃、5% CO培养箱中迁移12 h；将小室放入含结晶紫的甲醇溶液，固定15 min；显微镜下观察拍照，每组随机选取5个视野，计算迁移细胞数目。

1.10.3

内皮细胞成管实验 内皮细胞接种于24孔板，加0.3 μmol/L PGE刺激培养48 h；胰蛋白酶消化并制备细胞悬液；取Matrigel胶加入预冷96孔板中，板内接入细胞悬液，37 ℃、5% CO培养箱中培养6 h；显微镜下观察拍照，每组随机选取5个视野，计算内皮细胞成管数量。

2 结果

2.1 股动脉血管原代内皮细胞形态学观察及纯度检测

显微镜下可观察到大量独立、浑圆、透亮的原代内皮细胞贴壁生长(图1A)。流式细胞术检测细胞纯度为38.34%(图2)。分选细胞14～16 d，细胞汇集成单层。其呈三角形、卵型不规则形状，以铺路石最为常见，无接触抑制(图1B)。

图1 细胞生长概况A：原代内皮细胞；B：分选原代内皮细胞

图2 流式细胞术检测内皮细胞纯度A：阴性对照组；B：CD31阳性组

2.2 激光共聚焦法鉴定股动脉血管原代内皮细胞

分选后以激光共聚焦法检测细胞CD31表达情况，结果提示所得细胞均为CD31阳性(图3)，符合内皮细胞特征，股动脉血管原代内皮细胞分离成功。

图3 激光共聚焦法检测内皮细胞CD31表达

2.3 股动脉血管原代内皮细胞功能实验

2.3.1

PGE对股动脉血管原代内皮细胞活力以及增殖的影响 分选后内皮细胞接种于培养板中，加CCK-8以检测450 nm处的吸光度(optical density,OD)值。统计结果如图4A所示，PGE组较未刺激组，内皮细胞活力显著提高(

SD

=1.24±0.240 325，

t

=-3.751)。高内涵细胞成像法检测原代内皮细胞增殖能力，结果如图4B、C所示。测量视野中最大和最小的细胞核直径，设定软件识别细胞的直径范围，挑选荧光最强和最弱的细胞，测量荧光强度值，减去背景荧光强度，设定荧光强度的检测范围，调整两个参数圈出所有细胞，选择模块分析细胞总数，导出结果至Excel 表格，统计每孔细胞数量，分析细胞增殖能力。如图4B统计图可知，PGE刺激组较未刺激组，可显著促进内皮细胞增殖(

SD

=1 575±0.575 000，

t

=-3.197)。

图4 PGE2对内皮细胞活力及细胞增殖的影响A：CCK-8法检测原代内皮细胞活力统计图；B：高内涵成像法检测原代内皮细胞增殖能力统计图；C：高内涵细胞成像系统照片×10;与Normal组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3.2

PGE对股动脉血管原代内皮细胞迁移的影响 Transwell小室检测内皮细胞迁移功能，结晶紫染色后显微镜下观察如图5所示。与正常组相比，PGE刺激后内皮细胞迁移量明显增多。对细胞进行计数，经统计作图分析可知PGE可以显著增强内皮细胞的迁移能力(

SD

=1.334±0.334 000，

t

=-11.621)。

图5 PGE2对内皮细胞迁移的影响A:Normal组；B:PGE2组；与Normal组比较：**P<0.01

2.3.3

PGE对股动脉血管原代内皮细胞血管生成的影响 以Matrigel胶法检测内皮细胞成管功能，6 h成管能力良好。镜下视野如图6所示。与正常组比较，PGE刺激后细胞成管数量显著增加。计算各个视野中成管数量，经统计分析可知PGE可促进内皮细胞血管生成功能(

SD

=1.378±0.378 000，

t

=-10.124)。

图6 PGE2对内皮细胞血管生成的影响A:Normal组；B:PGE2组；与Normal组比较：**P<0.01

3 讨论

目前原代动脉血管内皮细胞提取分离方法多为组织块黏附法和酶消化法，内膜外翻法也可用作原代内皮细胞分离培养方法，但大鼠股动脉管径狭小，给外翻法操作带来困难。而酶消化法只需去除血管外部多余组织，即可进入消化步骤，效率显著提高。

CD31即血小板内皮细胞黏附分子(PECAM-1)，属于免疫球蛋白超基因家族，在内皮细胞中广泛表达。流式结果表明CD31阳性细胞比例为38.34%，流式分选出CD31阳性细胞，激光共聚焦进一步鉴定内皮细胞均为CD31阳性。综上所述，酶消化法成功获得CD31阳性原代血管内皮细胞。

血管内皮细胞是一层覆盖于血管腔表面连续的、扁平的单层鳞状细胞。其在生物体内具有调节血管舒张、维持凝血和纤溶系统的平衡、抑制血小板聚集、抑制炎症细胞与内皮细胞黏附的重要作用。在正常生理状态下，血管内皮细胞可维持机体稳定，其被活化后功能受损。

大鼠股动脉血管既是营养动物下肢最重要的血管之一，也是距离关节最近的动脉血管。本实验以大鼠为实验动物，探索出一种既简便又高效的股动脉血管内皮细胞分离方法，为研究相对较小血管来源的内皮细胞功能提供体外细胞模型。为与相对较小血管相关的疾病，如动脉粥样硬化、血管炎、脑小血管疾病、糖尿病肾病以及泌尿系统疾病等研究带来了便利。