黄连温胆汤调控NLRP3炎症小体抗动脉粥样硬化机制

杨金果 鞠建庆 汤献文 严权浩

(1北京中医药大学深圳医院(龙岗)，广东 深圳 518000；2中国中医科学院西苑医院)

心血管疾病(CVD)是全球首要死亡原因，严重威胁着人类身体健康，在我国，无论是冠心病还是脑卒中，其患病人数和死亡人数仍呈上升趋势，心血管病的疾病负担持续加重〔1〕。动脉粥样硬化(AS)是CVD的共同病理基础，其发病机制复杂，炎症反应学说是主流学说之一。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3炎性体是目前研究较为广泛和深入的炎性体，可促发炎症反应〔2〕，在AS发生、发展过程中起关键作用〔3，4〕。黄连温胆汤是临床经典方，广泛用于冠心病的治疗，动物实验亦表明其具有降脂、稳定斑块作用〔5〕。但其是否可通过抑制NLRP3炎症小体活化介导的炎症反应发挥作用尚无报道。本项目选取黄连温胆汤为干预措施，采用高脂饲料饲养的ApoE-/-小鼠为AS动物模型，以NLRP3炎症小体作为切入点，探究黄连温胆汤抗AS的干预效应。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及饲料 SPF级7～8周龄雄性ApoE-/-小鼠24只及相同周龄及遗传背景的雄性C57BL/6J小鼠6只，体质量(25±5)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，批号：1100111911017204。高脂饲料：购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：京饲证(2014)06057，批号：1103221900009954。

1.1.2实验药物 黄连温胆汤(黄连10 g、半夏15 g、竹茹10 g、枳实15 g、陈皮15 g、茯苓15 g、 生姜5 g、炙甘草5 g)中药饮片置于煎药机内，加5倍于药材质量的纯净水浸泡1 h，大火煮沸30 min，无菌纱布过滤，药渣再加5倍于药材质量的纯净水煮沸20 min，过滤后合并两次滤液，经旋转蒸发仪真空减压浓缩，制备成含生药1 g/ml的浓缩液，除菌后置于4℃冰箱保存备用。

1.1.3实验仪器 电子天平(Sartorius公司，型号：BSA3202S-CW)；小动物体重天平(上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002)；迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；雷杜酶标仪RT-6100；高清成像系统；佳能(Canon)EOS 5D。

1.1.4实验试剂 总胆固醇(TC)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号20190810)；三酰甘油(TG)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号20190810)；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号20190810)；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号20190810)；小鼠白细胞介素(IL)-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(48T)(江苏酶免实业有限公司，批号19101504)；小鼠IL-18 ELISA试剂盒(48T)(江苏酶免实业有限公司，批号19082903M)；Anti-NLRP3抗体(美国Abcam，批号ab214185)；Anti-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1抗体(美国Abcam，批号ab138483)。

1.2方法

1.2.1分组与造模 将24只ApoE-/-小鼠随机分为模型对照组、黄连温胆汤低剂量组、黄连温胆汤中剂量组、黄连温胆汤高剂量组，以高脂饲料饲养4 w，构建AS小鼠模型〔6～8〕。C57BL/6J小鼠6只为正常对照组，予以普通饲养喂养。

1.2.2给药 ApoE-/-小鼠继续高脂饲料饲养，并给予相应药物：黄连温胆汤低剂量组予黄连温胆汤〔9 g/(kg·d)〕，黄连温胆汤中剂量组予黄连温胆汤〔18 g/(kg·d)〕，黄连温胆汤高剂量组予黄连温胆汤〔36 g/(kg·d)〕。正常对照组继续普通饲料饲养，并予等体积生理盐水。每日灌胃1次。4 w后处死动物取材。

1.2.3检测指标

1.2.3.1血脂检测 小鼠眼球静脉丛取血，将离心管静置于室温2 h，待血液凝固成血块收缩后，3 000 r/min离心10 min，取上清于离心管中，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.2.3.2病理形态学观察 苏木素-伊红(HE)染色：小鼠主动脉根部组织石蜡包埋，切片，脱蜡，覆水，苏木素染液染色5 min，流水冲洗，1% 盐酸乙醇分化3～5 s，返蓝，0.5% 伊红染液染色1 min，脱水封片。观察后拍照。

1.2.3.3血清炎症因子IL-1β、IL-18检测 ELISA进行测定，操作过程中严格按照说明书步骤，将吸光度(A)值代入曲线方程中，计算出样品的浓度并进行数据分析。

1.2.3.4主动脉NLRP3、Caspase-1表达检测 小鼠主动脉根部石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水洗3 min 3次，3%过氧化氢(H2O2)封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4℃冰箱中过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)振荡清洗后分别滴加二、三抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规封片。观察后拍照。采用Image-pro-plus 6.0对图像进行分析。

1.2.4统计学方法 采用GraphPad Prism7.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠血脂水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组血清TC、TG、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，黄连温胆汤高剂量组血清TC显著降低(P<0.05)，黄连温胆汤低、中剂量组TC有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，黄连温胆汤低、中、高剂量组TG均显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，黄连温胆汤中、高剂量组血清LDL-C显著降低(P<0.05)，黄连温胆汤低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，黄连温胆汤低、中、高剂量组血清HDL-C差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠血清IL-1β、IL-18水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组IL-1β、IL-18水平均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，黄连温胆汤中剂量组和高剂量组IL-1β水平均显著降低(P<0.05)，黄连温胆汤低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，黄连温胆汤低、中、高剂量组IL-18水平均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组血脂水平及血清IL-1β、IL-18水平比较(n=6，mmol/L)

2.3黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉根部病理形态学影响 主动脉根部HE染色显示，正常对照组主动脉根部血管壁层次清晰，内膜完整，无AS斑块；模型对照组斑块沉积最为明显，管壁弥漫性增厚，斑块脂质核心大、数量多，可见大量泡沫细胞和胆固醇结晶沉积，纤维帽细薄或不连续，中膜变薄，呈易损斑块特征；各给药组主动脉根部斑块沉积程度有不同程度减轻。见图1。

2.4黄连温胆汤对ApoE-/-小鼠主动脉NLRP3、Caspase-1蛋白表达的影响 与模型对照组比较，黄连温胆汤中剂量组和高剂量组主动脉斑块中NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，黄连温胆汤低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、图3、表2。

图1 各组主动脉根部(HE染色，×50)

图2 各组主动脉根部典型病变区NLRP3(免疫组化染色，×60)

图3 各组主动脉根部典型病变区Caspase-1(免疫组化染色，×60)

表2 各组主动脉NLRP3、Caspase-1蛋白 表达水平比较(n=4，IOD)

3 讨 论

AS是冠心病、脑卒中等缺血性CVD的共同病理基础，一直是心血管病领域研究的重点和热点。AS发病机制复杂，2017年公布的CANTOS研究进一步论证和强化了炎症反应学说在AS发展中的核心地位，并首次证明了抗炎药物可以减少CVD的发病风险〔9〕。炎症小体是新近发现的一类介导天然免疫的大分子蛋白复合体，NLRP3炎性体是目前研究最广泛和最深入的炎症体。当胆固醇晶体、氧化低密度脂蛋白等激活NLRP3后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶前体(pro-Caspase-1)水解成为具有活性的Caspase-1，切割pro-IL-1β和pro-IL-18生成活性的IL-1β和IL-18，从而引起炎症反应；另外，NLRP3炎性体活化还能介导一种Caspase-1依赖性的促炎性程序性细胞死亡，即“细胞凋亡(pyroptosis)”〔10〕，从而促进炎症反应的扩散。2010年Duewell等〔11〕首次证明了NLRP3促AS作用；有研究报道AS患者主动脉中NLRP3表达显著升高，且与冠状动脉狭窄的严重程度及AS的危险因素呈正相关〔12〕，不稳定性斑块中NLRP3炎症小体及IL-1β和IL-18在表达显著高于稳定斑块〔13〕；均表明NLRP3炎症小体途径在AS发生发展中起重要作用，并影响斑块的稳定性。干预NLRP3炎症小体的激活有望成为AS防治的新靶点。目前已有动物实验表明NLRP3抑制剂MCC950和Arglabin在AS小鼠中发挥显著的抗炎和抗AS作用〔14，15〕，但尚未投入临床，其可靠性、安全性及与人类相似性需研究者进一步深入研究。

中医无“AS”相对应的病名，常归属于“眩晕”“胸痹”“中风”等范畴。中国中西医结合学会心血管病专业委员会血脂与AS学组制订的《动脉粥样硬化中西医结合诊疗专家共识》〔16〕，认为AS属本虚标实之证，标实涉及血瘀、痰浊、寒凝、气滞、热毒，本虚则为气虚、阴虚、阳虚，受气候、饮食、体质等因素影响，痰热互结是岭南地区常见病机之一〔17〕。黄连温胆汤首见于由清代陆廷珍编撰的《六因条辨》，药物组成为黄连、半夏、茯苓、陈皮、枳实、竹茹、炙甘草、生姜，具有清热燥湿化痰之效。现代药理研究显示，黄连温胆汤具有抗AS、抑制炎症反应、降低血糖等作用。动物实验表明黄连温胆汤具有抗AS，对减少粥样斑块和稳定粥样斑块均具有一定作用。本实验采用高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠构建AS易损斑块动物模型，以NLRP3炎症小体为切入点，探索其抗炎、抗AS的效应机制。

本实验结果显示：黄连温胆汤具有降脂作用，这可能为其抗AS作用机制之一。血清炎症因子IL-1β、IL-18水平显著降低，表明黄连温胆汤具有降低全身炎症反应作用。本研究病理形态学实验结果表明黄连温胆汤有稳定主动脉易损斑块的作用；免疫组化结果显示黄连温胆汤可能通过抑制主动脉组织中NLRP3炎症小体的活化，降低炎症因子IL-1β、IL-18的表达，从而发挥抗炎、抗AS的作用，为进一步深入研究黄连温胆汤抗AS的作用机制奠定了基础。